本科生设计性实验生化——蚕豆病

1、2012年设计性实验 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)

2、，尿液镜下未见红细胞。 （尿三胆）尿胆素（尿三胆）尿胆素（+）、尿胆红素）、尿胆红素()、尿胆素原、尿胆素原(+)肝肠肝肠循环循环增多增多胆红素胆红素单核单核吞噬吞噬系统系统降解降解血红素血红素红细胞破裂红细胞破裂血红蛋白渗出血红蛋白渗出尿蛋白尿蛋白(+)(1.0g/l)运氧功能障碍运氧功能障碍溶血性贫血溶血性贫血循环血量减少循环血量减少血压下降血压下降脉搏加快脉搏加快(心率加快心率加快)呼吸加快呼吸加快过多过多34.2umol/L时，时，黄疸黄疸血清总胆红素血清总胆红素 结合胆红素变化不大（水溶结合胆红素变化不大（水溶性大，随尿排出）性大，随尿排出）未结合胆红素未结合胆红素（水溶性（水溶性小

3、，不能随尿排出，有毒）小，不能随尿排出，有毒）酱油尿酱油尿理论依据 溶血性黄疸:由于红细胞的大量破坏，使胆红素产生过多，超过了肝细胞摄取结合的能力，使得尿中尿胆原和尿胆素含量增多。葡糖-6-磷酸脱氢酶缺乏，输血不当均会引起病症 蚕豆病：葡糖-6-磷酸脱氢酶缺乏。患者大多在食用蚕豆后发生急性溶血性贫血。典型病人常出现由于大量红细胞破坏释放出胆红素二导致的溶血性黄疸 ，恶心呕吐，尿液呈酱油样等症状 诱因：一天前食用蚕豆 既往史：姐姐也曾出现过此症状蚕豆病发病机制 食用蚕豆 产生大量过氧化氢，不被清除 红细胞膜脂质被氧化破坏 急性血管内溶血，产生过多胆红素 导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样

4、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏使磷酸戊糖途径受阻。NADPH+H+缺乏致血还原型谷胱甘肽生成不足。 红细胞被破坏，则可被肝等单核吞噬细胞识别并吞噬，释放血红蛋白，进一步分解为珠蛋白和血红素，而血红素被吞噬细胞降解为胆红素。 胆红素是人体内原型抗氧化剂，能够清楚超氧化剂和过氧化物自由基，因患儿体内有大量过氧化氢，氧化应激可诱导HO-1的表达，从而增加胆红素的量升高来抵御氧化应激状态。患儿正常（儿童）红细胞1.981.9810101212/L /L 4.04.0* *101012125.35.3* *10101212/L/L血红蛋白53g/L 53g/L 120120140g/L 140g/L 血清总胆

5、红素85.585.5mol/L mol/L 1.711.7117.1mol/L 17.1mol/L 结合胆红素13.713.7mol/L mol/L 0 03.42mol/L 3.42mol/L 未结合胆红素71.871.8mol/L mol/L 0 013.68mol/L 13.68mol/L 尿蛋白(+)(+)潜血(+)(+)尿胆红素(-) (-) 尿胆素原(+)(+)从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 主要临床表现：1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白 2. 皮肤及巩膜黄染 3. 体温升高 4. 呼吸急促1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白G6PDGSH的主要作用：的主要作用： 保护红

6、细胞内的含硫氢基保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜）血红蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化蛋白的完整性，免遭氧化 与谷胱甘肽过氧化酶共同使与谷胱甘肽过氧化酶共同使 H2O2还原成还原成H2ONADPH+H+红细胞的抗氧化能力红细胞的抗氧化能力GSH红细胞红细胞 膜破裂膜破裂溶血性贫血溶血性贫血（面色苍白）（面色苍白）游离游离Hb肾肾 吸收阈值吸收阈值血红蛋白尿血红蛋白尿/含铁血黄素尿含铁血黄素尿2. 皮肤及巩膜黄染3. 体温升高机理： 红细胞破裂 血红蛋白暴露 免疫系统攻击（单核-吞噬细胞系统） 体温升高4. 呼吸急促溶血性贫血 具有载O2能力的Hb含量下降机体缺O2

7、呼吸急促实验设计实验设计高铁血红蛋白还原法高铁血红蛋白还原法实验思路 患者姐姐出现过此类状况推测属于家族性遗传，且患者在食用蚕豆后出现症状，故即有可能为蚕豆病。6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏影响高铁血红蛋白的还原，故可以依据如下反应机制设计实验。亚铁血红蛋白亚铁血红蛋白 高铁血红蛋白高铁血红蛋白高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白还原酶 NADPH(辅酶辅酶) 亚甲蓝亚甲蓝(递氢体递氢体)亚硝酸钠亚硝酸钠实验反应方向一、实验目的 1、检测患者体内6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性以及发病原因 2、掌握高铁血红蛋白还原法测6-磷酸葡萄糖脱氢酶的实验原理及方法 3、了解蚕豆病的发病机制及原因二、实验原理 在全血中加入亚

8、硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）。三、实验器材及试剂 器材：离心机、分光光度计、微量移液器 水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，试管 试剂： 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液； 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 ； 0. 28 mol/L 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）生理盐水、抗凝剂、 患者静脉血、蒸馏水四、实验步骤

9、1、取静脉血1.8mL于抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg），混匀2、离心沉淀1000r/min15min3、调整血细胞血浆=11，混匀，（调整后全血）4.1ml0.18 mol/L亚硝酸钠、1ml0.28mol/L葡萄糖溶液、0.14 mmol/L亚甲基蓝液，混匀，得到混合试剂1ml 5、取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/ mL 0. 01 / /生理盐水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亚硝酸钠- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL 0. 1 0.

10、 1 0. 1来回摇动1520 次,置37 水浴箱静置3 h蒸馏水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 试剂 A B SB管为空白管,在波长635nm处，测定“A”管及“S”管吸光度五、实验结果 实验结果计算：计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 % 计算出其还原率与正常值比较六、实验分析 该患者可能患有先天性镰刀贫血症或蚕 豆病。 正常的高铁血红蛋白还原率75%，若计算所得还原率低于75%，且患者姐姐也有类似症状，患者吃过蚕豆后发病，故可推断患者患有蚕豆病七、注意事项1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整到0.

11、35-0.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果，故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？我组讨论认为：要想探讨该病发生的分子基础 ，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNA序列检测DNA序列测定方法直接法直接法间接法间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）来粗略的估计待分析）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同基因的一

12、级结构是否与对照基因相同双脱氧末端终止法（双脱氧末端终止法（Sanger法）法）化学裂解法（化学裂解法（Maxam-Gilbert法）法）DNA的自动化测序的自动化测序DNA序序列列测测定定方方法法患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？ 我们认为体型瘦小与该病有关，原因分析如下： 溶血性贫血 红细胞比容下降 营养物质运输不足（糖、蛋白质、脂类物质代谢障碍） 缺乏营养 体型瘦小实验思路 患者姐姐出现过此类状况推测属于家族性遗传，且患者在食用蚕豆后出现症状，故即有可能为蚕豆病。6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏影响高铁血红蛋白的还原，故可以依据如下反应机制设计实验。亚铁血红蛋白亚铁血红蛋白 高铁血红蛋白高铁

13、血红蛋白高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白还原酶 NADPH(辅酶辅酶) 亚甲蓝亚甲蓝(递氢体递氢体)亚硝酸钠亚硝酸钠实验反应方向一、实验目的 1、检测患者体内6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性以及发病原因 2、掌握高铁血红蛋白还原法测6-磷酸葡萄糖脱氢酶的实验原理及方法 3、了解蚕豆病的发病机制及原因二、实验原理 在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）。三、实验器材及试剂 器材：离心机、分光光度计、微量移液器 水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，试管 试剂： 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液； 0