酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP和MMP活性

1、会计学1酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP和和MMP活性活性电泳设备电泳设备垂直电泳系统垂直电泳系统水平电泳系统水平电泳系统聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称，简称Acr)和交联剂和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(N,N -methylene-bisacylamide,简称简称Bis)在加速剂在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称，简称TEMED)和催化剂过硫酸

2、铵和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称，简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称PAGE)。N,N-甲叉（亚甲基）甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺双丙烯酰胺催化剂催化剂 丙烯酰胺丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：1.1.在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性

3、，机械性能好；2.2.化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；3.3.对对pHpH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；4.4.几乎无吸附和电渗作用，只要几乎无吸附和电渗作用，只要AcrAcr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；5.5.样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达1010-6-6g g；6.6.凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及

4、交联剂的浓度调节凝胶的孔径；度调节凝胶的孔径；7.7.分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。SDSPAGE的原理的原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。而而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量

5、亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

6、而强还裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。的电荷差异和结构差异。因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决

7、于蛋白质分子大小。因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的蛋白质混合物分离能力的关系蛋白质混合物分离能力的关系5 510101515292945456666979720020029294545666697972002002929454566669797200200肿瘤细胞的侵袭移动肿瘤细胞的侵袭移动CBAD肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的步骤：肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的

8、步骤：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。细胞间基质结构示意图细胞间基质结构示意图细胞外基质细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖组成。葡聚糖组成。ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜

9、在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存的形式存在，在细胞间结构以间质结缔组织在，在细胞间结构以间质结缔组织(interstitial connective tissue)形式存在。形式存在。胶原是胶原是ECM的主要成分，目前已发现，至少有的主要成分，目前已发现，至少有12种不同胶原类型，其中以种不同胶原类型，其中以I、型胶原是间质结缔组织中的主要成分。型胶原是间质结缔组织中的主要成分。型胶原则主要存在于基底膜内。型胶原则主要存在于基底膜内。肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖

10、、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。键分子及其信号通路。肿瘤细胞通过其表面受体与肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的

11、肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金属蛋白酶和金属蛋白酶(metalproteinase, MMP)类，如胶原酶类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。、基质降解酶、透明质酸酶。MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分布在胞质中，后者表达在膜上。胞质

12、型布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨根据其作用底物的特异性、敏感性及氨基酸序列的同源性分为三大类：基酸序列的同源性分为三大类： （1）间质胶原酶，包括）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间，其作用底物主要为间质胶原质胶原, 即即、和和、型胶原型胶原, 但不能降解明胶和但不能降解明胶和型胶原；型胶原； （2）明胶酶，包括）明胶酶，包括MMP-2和和MMP-9,其作用底物主要是其作用底物主要是型胶原和明胶，还可降解型胶原和明胶，还可降解、型胶原型胶原,但不能降解间质胶原；但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解

13、素，包括）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和和MMP-11，其作用底物主要是，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素，间充质溶解素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解、型胶原酶以及型胶原酶以及型胶原的氨基端。型胶原的氨基端。通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、

14、神经等许多疾病过程。等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。 基质金属蛋白酶蛋白家族基质金属蛋白酶蛋白家族MMP-2又叫明胶酶又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量为为72kDa。MMP-9又称为明胶酶又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。分子量为。分子量为92kDa，是，是MMPs中分子量最大的酶。中分子量最大的酶。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase a

15、ssociated lipocalin，NGAL)是是1993年年Kjeldsen等人在研究等人在研究MMP-9在细胞内存在形式时发现的，它能够在细胞内存在形式时发现的，它能够与与MMP-9聚合形成异源二聚体，保护和调节聚合形成异源二聚体，保护和调节MMP-9活性，从而促进恶变细胞的浸活性，从而促进恶变细胞的浸润和转移。润和转移。检测检测MMP-9和和MMP-2的活性，对分析肿瘤细胞恶性程度和预后提供帮助。的活性，对分析肿瘤细胞恶性程度和预后提供帮助。由由N 端的端的310螺旋、螺旋、C 端的端的螺旋和中间的和中间的八段反平行的螺旋和中间的和中间的八段反平行的折叠所构成，这折叠所构成，这八段反

16、平行式八段反平行式折叠构成了一个折叠构成了一个折叠桶结构。折叠桶结构。此此折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N 端端310螺旋所封闭。在螺旋所封闭。在折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。NGAL的三级结构的三级结构MMP-2的结构的结构Pre: 信号肽序列信号肽序列Pro: 带巯基的前肽带巯基的前肽Zn: Zn离子结合部分离

17、子结合部分II: 能结合胶原的能结合胶原的II型纤维结合素结构域型纤维结合素结构域H: 绞链区绞链区Hemopexin：类血红素蛋白结构，由四段重复序列组成，其中：类血红素蛋白结构，由四段重复序列组成，其中第一个与第四个间存在一第一个与第四个间存在一 个二硫键。个二硫键。MMP-9的结构的结构由三个由三个螺旋与螺旋与5个个折叠构成折叠构成含有含有2个锌离子和个锌离子和5个钙离子个钙离子右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个锌离子结合右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个锌离子结合NGAL能与能与MMP-9以二硫键的方式结合，能起到保护和调节以二硫键的方式结合，能起到保护和调

18、节MMP-9功能的作用，所以功能的作用，所以NGAL与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有pcDNA3 空白质粒空白质粒载体的载体的SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有pcDNA-NGAL (-) 的的SHEEC 细胞细胞分泌的分泌的MMP-9 和和MMP-2的活性均明显降低；而与此同时，转染有的活性均明显降低；而与此同时，转染有pcDNA-NGAL () 的的SHEEC 细胞分泌的细胞分泌的M

19、MP-9 和和MMP-2的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使NGAL 基因表达发生改变可以对基因表达发生改变可以对SHEEC 细胞分泌的细胞分泌的MMP-9 和和MMP-2 的活性产生明显影响。的活性产生明显影响。M：蛋白：蛋白marker；1. 细胞培养基；细胞培养基；2. pcDNA3；3. pcDNA-NGAL ( + )；4. pcDNA-NGAL ( - ) MMP-2和和MMP-9活性的强弱与肿瘤浸润和转移的能力密切相关。明胶是这两种酶的活性的强弱与肿瘤浸润和转移的能力密切相关。明胶是这两种酶的底物。所以在体外通过酶谱法（底物。所以在

20、体外通过酶谱法（Zymography）检测样品（组织，细胞培养液，血清，）检测样品（组织，细胞培养液，血清，血浆，尿）中血浆，尿）中MMP-2和和MMP-9的活性，对了解肿瘤细胞的恶性程度、监测治疗效果的活性，对了解肿瘤细胞的恶性程度、监测治疗效果和评价预后具有重要的指导意义。和评价预后具有重要的指导意义。酶谱法的基本过程是先将样品进行酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含，含0.1明胶）电明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和和MMP-9恢复恢复活性，在各自的

21、迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和和MMP-9活性成正比。活性成正比。实验原理实验原理实验操作实验操作样品制备样品制备: : 血清、血浆和尿样品可取适量直接与血清、血浆和尿样品可取适量直接与2SDS 样品缓冲液等体积混匀进行下样品缓冲液等体积混匀进行下一步实验，如酶活性太高造成显带不理想，可适当进行稀释一步实验，如酶活性太高造成显带不理想，可适当进行稀释;凝胶的制备凝胶的制备: : 玻璃板对齐后放入夹

22、中垂直卡紧。按表格配玻璃板对齐后放入夹中垂直卡紧。按表格配10分离胶，加入分离胶，加入TEMED后后立即摇匀即可灌胶，灌胶时，可用立即摇匀即可灌胶，灌胶时，可用5ml加样枪吸取凝胶沿玻璃板加进去，然后胶上加一加样枪吸取凝胶沿玻璃板加进去，然后胶上加一层异丙醇，以隔离空气中的氧，促进凝胶聚合（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需层异丙醇，以隔离空气中的氧，促进凝胶聚合（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时凝胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡）。约高度时要放慢速度。操作时凝胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡）。约几分钟后当异丙醇和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，

23、再等几分钟后当异丙醇和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等3min使胶充分凝固使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面表格配就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面表格配4的浓缩胶，加入的浓缩胶，加入TEMED后后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出固后，两手分别捏住梳子

24、的两边竖直向上轻轻将其拔出;在每个加样孔中加入在每个加样孔中加入10 l样品样品;电泳：电泳： 在在4 100V下，约下，约2h;凝胶的处理：凝胶的处理： （1）电泳结束后，取下凝胶，放入平皿中，用洗涤缓冲液在室温摇动下洗涤）电泳结束后，取下凝胶，放入平皿中，用洗涤缓冲液在室温摇动下洗涤1h，其间换，其间换液一次；液一次； （2）弃去洗涤缓冲液，然后加入孵育缓冲液没过胶面，至）弃去洗涤缓冲液，然后加入孵育缓冲液没过胶面，至37恒温箱中，恒温箱中，24h后取出；后取出； （3）弃去孵育缓冲液，加入）弃去孵育缓冲液，加入0.1%考马斯亮蓝染液染色约考马斯亮蓝染液染色约30min，回收染液，加入脱色

25、液，回收染液，加入脱色液脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5乙酸中止脱色；乙酸中止脱色； （4）待凝胶在）待凝胶在5乙酸中恢复到适当大小后，用凝胶图象处理系统分析结果，以白色条乙酸中恢复到适当大小后，用凝胶图象处理系统分析结果，以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶活性。带的净光密度值相对定量样品中酶活性。预期实验结果预期实验结果N N P P 135kD92kD72kDNGAL/MMP-9Pro-MMP-2MMP-9电泳设备电泳设备垂直电泳系统垂直电泳系统MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分家族成员根据其在

26、细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨根据其作用底物的特异性、敏感性及氨基酸序列的同源性分为三大类：基酸序列的同源性分为三大类： （1）间质胶原酶，包括）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间，其作用底物主要为间质胶原质胶原, 即即、和和、型胶原型胶原, 但不能降解明胶和但不能降解明胶和型胶原；型胶原； （2）明胶酶，包括）明胶酶，包括MMP-2和和MMP-9,其作用底物主要是其作用底物主要是型胶原和明胶，还可降解型胶原和明胶，还可降解、型胶原型胶原,但不能降解间质胶原；但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和和MMP-11，其作用底物主要是，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素，间充质溶解素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解、型胶原酶以及型胶原酶以及型胶原的氨基端。型胶原的氨基端。通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态