细胞计数及观察

1、细胞培养（四）细胞培养（四） 暨暨 南南 大大 学学 医医 学学 院院 生物化学教研室生物化学教研室 费费 嘉嘉细胞培养的应用价值细胞培养是生命科学研究中常用的、基本的技术细胞培养是生命科学研究中常用的、基本的技术 体外细胞培养使长时间直接观察活细胞的形态结体外细胞培养使长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动的动态过程，故可用于细胞学、遗构和生命活动的动态过程，故可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作；研究工作； 该方法能排除神经体液因素的影响及肝肾解毒功该方法能排除神经体液因素的影响及肝肾解毒功能的干扰，观察某些因素和药

2、物对培养细胞的直能的干扰，观察某些因素和药物对培养细胞的直接作用。接作用。 节约经费节约经费 可生产生物制品、单克隆抗体和基因工程可生产生物制品、单克隆抗体和基因工程制品等多种产品制品等多种产品 细胞培养方法的缺点 培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。细胞形态和功能会发生一定程度的改变。 培养方法、试剂对细胞形态和功能有一定影响。培养方法、试剂对细胞形态和功能有一定影响。 长期体外培养细胞，由于反复传代、冻存和操作长期体外培养细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，等因素的影

3、响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。呈永生化或癌变的特征。细胞计数细胞计数细胞生长状况的观察细胞生长状况的观察- - 细胞数目测定技术细胞数目测定技术 原理：计数室的边长为原理：计数室的边长为1 1mmmm，中间平台下陷中间平台下陷0.10.1mmmm，盖上盖片后计数室的容积为盖上盖片后计数室的容积为 0.1 0.1mmmm3 3。根根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量，以细胞数积中细胞的数量，以细胞数/ /毫升表示毫升表示 。 实验程序：实验程序： 制备样品制备样品 取悬浮细胞或细胞悬液，稀释取悬浮细胞或细胞悬

4、液，稀释到一定比例。到一定比例。检查记数板检查记数板 （1 1） 擦洗擦洗 （2 2） 冲洗冲洗 （3 3） 镜检镜检 加样加样 先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续连续2323次，直至充满计数板和盖玻片间的次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。空隙。Freshney) 计数计数 （1 1） 找计数室找计数室 在低倍显微镜下寻找计数板在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格网位置。上的大方格网位置。（2 2） 转高倍镜转高倍镜 使细胞和计数室线条均清晰使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将

5、计数室一角的中格移至视野中。为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。（3 3）计数）计数 计算计数板的四角大格内的细胞数，计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右和下的不计算压线者只计算左侧和上方的，右和下的不计算在内。在内。 （4 4） 清洗清洗 细胞数计算公式：细胞数计算公式：细胞数细胞数/ /毫升培养液毫升培养液 = = 注意事项注意事项： 1 1、 加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。 2 2、 镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。的细胞团，应按单个细胞计算。 3 3

6、、 如细胞团占如细胞团占10%10%以上，说明消化不充分，以上，说明消化不充分，或细胞数少于或细胞数少于200200个个/10/10平方毫米或多于平方毫米或多于500500个个/10/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液，再重新计数。悬液，再重新计数。 Hand Tally Counter 培养细胞一代生存期培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种并培养一段时间，直到下次传代。这已成为培养工作中的一种习惯说法。 如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。 细胞一代与细胞世代（Generation）或倍增D

7、oubling不同，在细胞一代中，细胞能倍增36次。 细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 1潜伏期 2指数增生期 3停滞期1 1潜伏期（潜伏期（Latent PhaseLatent Phase） 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。 接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁期，悬浮期结束。 细胞贴壁后，还需要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期，这一阶段称为细胞潜伏期。 细胞处在潜伏期时，可有运动活动，但基本无增殖，分裂相鲜见。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。 细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等

8、密切相关。v初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时。v细胞接种密度大时潜伏期短。 这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。 指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。 一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。v一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。vpH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。 指数增生期是细胞一代

9、中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。 在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞接触抑制（细胞接触抑制（Contact InhibitionContact Inhibition） 细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。 恶性细胞无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。细胞密度抑制（细胞密度抑制（Density InhibitionDensity Inhibition） 肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空

10、间扩展，使细胞发生堆积。 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。 当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。3 3停滞期（停滞期（Stagnate PhaseStagnate Phase） 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。 停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，并且传代应越早越好。细胞生长相关指标 细胞群体倍增

11、时间细胞群体倍增时间:在对数生长期，在对数生长期，细胞数量增加一倍的时间 TD=t*log2/(logNt-logNo) 细胞分裂指数细胞分裂指数(MI)：1000个细胞中细胞分裂相的数目二、细胞传代二、细胞传代 -将培养的细胞分散后，从一个容器以适将培养的细胞分散后，从一个容器以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，称为传代培养。养，称为传代培养。 传代培养的累积次数就是细胞的代数。传代培养的累积次数就是细胞的代数。一）、悬浮细胞的传代培养一）、悬浮细胞的传代培养步骤：步骤： 1 1轻轻振荡培养液，悬起细胞，后倒出轻轻振荡培养液，悬起细胞，后倒出/ /

12、吸出细吸出细胞培养液胞培养液 2. 10002. 1000转转/ /分离心分离心5-105-10minmin，弃去培养基。弃去培养基。 3. 3. 加入新鲜的培养基，重悬细胞沉淀，细胞悬液加入新鲜的培养基，重悬细胞沉淀，细胞悬液计数，取适量细胞悬液加到新培养液中，置计数，取适量细胞悬液加到新培养液中，置3737孵箱中培养。孵箱中培养。二二) )、贴壁细胞的传代培养、贴壁细胞的传代培养步骤：步骤： 1 1 倒去细胞培养液。倒去细胞培养液。 2 2 清洗清洗 PBSPBS 3 3 消化消化 0.25% 0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 4 4 终止消化终止消化 细胞培养液（含血清）细胞培养液（含血清）

13、5. 5. 离心收集细胞离心收集细胞 500 1000 500 1000 rpmrpm 6. 6. 传代培养传代培养 5 510105 5细胞细胞/ /mlml消消 化化 在光学显微镜下观察，当细胞变圆，细胞与细胞在光学显微镜下观察，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。片，表明消化时间未到。 翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可倾去消化液。膜出现针孔大小空隙时即可倾去消化液。 如见大量细胞片状脱落，已消化过头，则不能倾如见大量细胞片

14、状脱落，已消化过头，则不能倾倒消化液而直接进行下一步操作。倒消化液而直接进行下一步操作。二、活细胞的观察二、活细胞的观察 细胞活力细胞活力 - - 在细胞群体中活细胞所占的百分比叫在细胞群体中活细胞所占的百分比叫做细胞活力做细胞活力v由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。分离的过程对细胞是否有损伤作用。v复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。的效果。 ( (一一) )台盼兰染色操作步骤：台盼兰染色操作步骤： 1 1、制备细胞悬液。制备细胞悬液。2 2、以、以1 1：1 1

15、的比例加入的比例加入0.4%0.4%台盼兰染液，染色台盼兰染液，染色2 2一一3 3分钟。分钟。3 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计算细胞活力。数，计算细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。无色透明状。 ( (二二) )染色法染色法原理：利用活原生质体有选择吸收外界物质原理：利用活原生质体有选择吸收外界物质的特性，用染料处理时，活原生质体

16、不吸收染的特性，用染料处理时，活原生质体不吸收染料，细胞未染上颜色，而死细胞立即吸附大量料，细胞未染上颜色，而死细胞立即吸附大量染料而染上颜色。染料而染上颜色。细胞活力（细胞活力（%）= = 未染色的细胞数未染色的细胞数/ /观察的细胞总观察的细胞总数数 100 100（三）相差显微镜直接观察法（三）相差显微镜直接观察法 相差显微镜（相差显微镜（phasecontrastphasecontrast microscope microscope）由由P PZernikeZernike于于19321932年发明，并因此获年发明，并因此获19531953年诺年诺贝尔物理奖。贝尔物理奖。 这种显微镜最大

17、的特点是可以观察未经染色这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。的标本和活细胞。 基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。各种结构变得清晰可见。 操作方法：直接将培养的细胞（细胞培养瓶、操作方法：直接将培养的细胞（细胞培养瓶、培养皿）放置在相差显微镜的光路中，即可直培养皿）放置在相差显微镜的光路中，即可直接观察。接观察。 相差显微镜观察注意事项：相差显微镜观察注意事项：v1 1、培养器皿质量过关、培养器皿质量过关 v2 2、原代培养的细胞或

18、将要传代的细胞进行相、原代培养的细胞或将要传代的细胞进行相差显微镜观察和照相时，最好在换液后进行。差显微镜观察和照相时，最好在换液后进行。v3 3、无菌观念、无菌观念 （四）（四）MTTMTT法法 原理：活细胞中的琥珀酸脱氢酶能将原理：活细胞中的琥珀酸脱氢酶能将MTTMTT还原还原成不溶于水的蓝色产物成不溶于水的蓝色产物-甲臜，并沉淀在细甲臜，并沉淀在细胞中，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈胞中，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。但死细胞没有这一功能。正比。但死细胞没有这一功能。- - 区分活细胞和死细胞。区分活细胞和死细胞。 DMSODMSO能溶解沉积在细胞中的蓝色结晶，溶能溶解沉积在细胞中的蓝色结晶，溶液颜色的深浅与所含的甲臜的量成正比。液颜色的深浅与所含的甲臜的量成正比。- - 广泛用于新药筛选、细胞毒性实验、肿瘤广泛用于新药筛选、细胞毒性实验、肿瘤放射敏感性实验等。放射敏感性实验等。 MTTMTT法操作步骤：法操作步骤： l l、配制配制MTTMTT溶液。溶液。2 2、