引物设计及测序结果分析-PPT(精)

1、第四章第四章 PCR引物设计引物设计及测序结果分析及测序结果分析Contentp聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR） 的技术的技术原理及结果分析原理及结果分析pPCR引物设计原理及相关软件的使引物设计原理及相关软件的使用（用（ Primer Premier 5.0 ）p测序结果分析测序结果分析一一 . PCR的技术原理及结果分析的技术原理及结果分析v聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain (polymerase chain reaction,PCRreaction,PCR) )，是一种在体外快速扩增特定基因或，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法序列的方法

2、，故又称为基因的体外扩增法。，故又称为基因的体外扩增法。vPCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。 PCR技术原理技术原理 以拟扩增的以拟扩增的DNADNA分子为模板，以一对分别与分子为模板，以一对分别与模板模板55末端和末端和33末端互补的寡核苷酸片段为引末端互补的寡核苷酸片段为引物

3、，在物，在DNADNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的制沿着模板链延伸直至完成新的DNADNA合成，重复这合成，重复这一过程，即可使目的一过程，即可使目的DNADNA片段得到扩增。片段得到扩增。正义链正义链反义链反义链基本分子生物学研究手段基本分子生物学研究手段PCRPCRPCR反应液体的成分反应液体的成分: :PCRPCR循环的程序循环的程序: :PCRPCR原理：原理：基本分子生物学研究手段基本分子生物学研究手段RT-PCR反转录反转录PCRmRNA-cDNA-PCR基本分子生物学研究手段基本分子生物学研究手段Cutting

4、by enzymes 基本分子生物学研究手段基本分子生物学研究手段Southern Blot基本分子生物学研究手段基本分子生物学研究手段Northern Blot模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。Tm在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA94C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链72C变性退火延伸 PCRPCR出现的问题：出现的问题： PCRPCR扩增未得到目的条带？扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？）？ 扩增的目的条带很弱？扩增的目的条

5、带很弱？引物是否合适?引物设计是引物设计是PCR 技术中至关重要的一环技术中至关重要的一环PCR结果分析结果分析PCR结果。结果。12、PCR产物（产物（3ul样品）样品）1. 1. 无扩增产物无扩增产物 模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适对样品不合适 引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解 退火温度太高退火温度太高2. 2. 非特异性扩增非特异性扩增 引物特异性差引物特异性差 模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高 酶量过多酶量过多 退火温度偏低退火温度偏低 循环次数过多循环次数过多3. 3. 拖尾拖尾产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状

6、态 M 1 2模板不纯或降解模板不纯或降解BufferBuffer不合适不合适退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)交叉污染交叉污染 对策对策 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；溅出离心管外； 除不能耐高温的物质外，所有试剂器除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。性使用。 各种试剂先进行分装，低温贮存。各种试剂先进行分装，低温贮存。

7、 设置阳性和阴性对照，重复实验设置阳性和阴性对照，重复实验1、目的基因的克隆：、目的基因的克隆： PCR技术为在重组技术为在重组DNA过程中获得目的基过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变：、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR的应用的应用3、DNA和和RNA的微量分析：的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是，是DNA和和NA微量分析的最好方法。实际工作中，微量分析的最好方

8、法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平可检测不同组织或细胞中基因的转录水平.5、基因突变分析：、基因突变分析：利用利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。变检测的敏感性。二二. PCR引物设计原理及相关软件的使用引物设计原理及相关软件的使用（ Primer Premier 5.0 ）v引物引物v

9、引物的重要性引物的重要性v引物设计的原则引物设计的原则v引物同源性分析引物同源性分析v引物设计软件引物设计软件v如何使用如何使用Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0v酶切位点及保护碱基的添加酶切位点及保护碱基的添加引物（引物（primers)v引物是人工合成的两段寡引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端引物与感兴趣区域另一端的另一条的另一条DNA模板链互补模板链互补。(上游引物与上游引物与DNA序列一序列一致致,下游引物要反相互

10、补下游引物要反相互补.)3355Sense primerAntisense primer引物的重要性引物的重要性v在整个在整个PCR体系中体系中, 引物占有十分重要的引物占有十分重要的地位。地位。PCR的特异性要求引物与靶的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的特异结合，不与其他非目的DNA结合，结合，PCR的灵敏性要求的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。结果密切相关。引物设计原则引物设计原则v引物长度引物长度 v碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性vTm值值v引物二级结构引物二级结构v引物

11、引物3端端v引物引物5端端v引物的内部稳定性引物的内部稳定性v引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性v扩增区域的二级结构扩增区域的二级结构引物与模板的序列要引物与模板的序列要紧密互补紧密互补引物与引物之间避免形成引物与引物之间避免形成稳定的二聚体稳定的二聚体或发夹结构或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA DNA 聚合反应聚合反应( (即错配即错配) )。 基本原则：基本原则：引物长度（引物长度（primer lengthprimer length）产物长度（产物长度（product lengthproduct length）序列序列Tm Tm 值值(m

12、elting temperature)(melting temperature)形成引物二聚体形成引物二聚体(primer dimer)(primer dimer)及发夹结构（及发夹结构（duplex formation and hairpinduplex formation and hairpin）的能值）的能值在错配位点（在错配位点（false priming sitefalse priming site）的引发效率）的引发效率引物及产物的引物及产物的GCGC含量（含量（compositioncomposition）具体因素：具体因素：一般原则：一般原则：1. 引物的长度引物的长度：配对引

13、物的长度一般在：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。之间比较合适。v 尽可能使用两条引物的尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过值相同（最好相差不要超过 5） vTm值的计算值的计算：一般的公式：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的引物的GC%含量含量：一般为：一般为40%-60%。上。上下游引物的下游引物的GC含量不能相差太大。含量不能相差太大。3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是尤其是3端相似性较高的序列，否则容易端相似性较高的序列，否则容易导致错配。导致错配。4. 引物引物3端的末位碱基

14、避开密码子的第端的末位碱基避开密码子的第3位，位，且最好不选择且最好不选择A5. 引物的引物的5端可以修饰，而端可以修饰，而3端不可修饰。端不可修饰。 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；两个引物长度的引物二聚体； 发夹结构发夹结构引物二聚体引物二聚体7. 引物引物5端可以有与模板端可以有与模板DNA不配对碱基不配对碱基，在，在5端引入一段非模板依赖性序列。端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切

15、位点点5端加上适当数量的保护碱基）。端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。中引入该位点的点突变以作研究。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。素、地高辛等）。8. 引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性v保守性：通用引物保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可检测同一类病原微生物尽可能多的型别能多的型别v特异性：避免非特异性扩增特异性：避免非特异性扩增引物同源性分析引物同源性分析v用用Blastn软件进行同源性比较软件进行同源性比较尽可能选

16、择与非目的基因同源性小的序列作为尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物引物选择选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物端与非目的基因不同源的序列作为引物引物设计软件引物设计软件vPrimer Premier 5.0 生物软件网下载生物软件网下载安装后，用文本编辑器打开安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将，将vspace=DU改为改为vspace=PU便可以使用全部功能。便可以使用全部功能。 vOligovprimer 3vThe Primer GeneratorvNetPrimer如何使用如何使用Primer Premier 5.0v引物设计引物设计一般引物设计一般引物设计5带酶切

17、位点引物设计带酶切位点引物设计巢式巢式PCR引物设计引物设计多重多重PCR引物设计引物设计v探针设计探针设计v引物评析引物评析Primer Premier 5.0主要功能主要功能:1 1、引物设计、引物设计2 2、限制性内切酶位点分析、限制性内切酶位点分析3 3、DNA DNA 基元基元(motif)(motif)查找查找4 4、同源性分析、同源性分析Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍Preimer Premier 启动界面Load sequencehttp:/Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to tran

18、slate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好Choose a function 引物设计界面引物设计界面引物设计界面引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer引物编辑引物编辑引物编辑引物编辑编辑引物分析引物结果确认编辑的引物 酶切位点及保护碱基的添加酶切位点及保护碱基的添加酶切位点的查找酶切位点的查找酶切位点的选择原则酶切位点的选择原则:1.DNA序列当中不含有该酶切位点序列当中不含有该酶切位点.2.载体中只在多克隆位点含有该酶切位点载体中只在多克隆位点含有该酶切位点.3. 按照酶