蛋白质纯化技术复习过程

1、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化(chn hu)与鉴与鉴定定Isolation, Purification and Identification of Protein第一页，共84页。分子生物学圣经分子生物学圣经分子克隆实验分子克隆实验(shyn)指南指南第二页，共84页。为什么要纯化为什么要纯化(chn hu)蛋白质？蛋白质？理论意义：深入研究某种蛋白质的功能理论意义：深入研究某种蛋白质的功能(gngnng)以及作用机制，如信号通路以及作用机制，如信号通路中的蛋白质中的蛋白质应用价值应用价值-蛋白质工程蛋白质工程 医药、工业、科研医药、工业、科研 作为药物靶点作为药物靶点蛋白质是生命蛋白质是

2、生命(shngmng)(shngmng)功能的执行者功能的执行者第三页，共84页。蛋白质工程蛋白质工程(gngchng)中进行蛋白质纯化中进行蛋白质纯化的必要性的必要性 首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结构与功能；研究其结构与功能； 其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料；的蛋白质作为原材料； 最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化(chn hu)，从而开发出相关产品。，从而开发出相关产品。第四页

3、，共84页。本章本章(bn zhn)概要概要蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质纯化原则蛋白质纯化原则(yunz)纯化步骤纯化步骤蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定第五页，共84页。一、蛋白一、蛋白(dnbi)纯化方法纯化方法蛋白质纯化蛋白质纯化(chn hu)的根据：的根据： 不同的蛋白质，理化性质不同。不同的蛋白质，理化性质不同。理化性质不同的原因：理化性质不同的原因： 氨基酸的数目和序列不同。氨基酸的数目和序列不同。第六页，共84页。1.与蛋白质分离与蛋白质分离(fnl)纯化相关的理化纯化相关的理化特性特性分子大小分子大小(dxio)分子形状分子形状带电特性带电特性溶解特性溶解特性与配体特异性结合不

4、同与配体特异性结合不同吸附性质吸附性质变性和复性变性和复性第七页，共84页。1.1分子分子(fnz)大小大小蛋白质分子大小主要取决于：蛋白质分子大小主要取决于： 蛋白质肽链的数目蛋白质肽链的数目 每条肽链的氨基酸残基数目。每条肽链的氨基酸残基数目。几百几百百万百万 Da常用方法常用方法透析透析超滤超滤凝胶过滤凝胶过滤(gul)离心离心第八页，共84页。 透析透析(dialysis)利用利用(lyng)透析袋透析袋把大分子蛋白质与小把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方分子化合物分开的方法。法。第九页，共84页。第十页，共84页。 超滤法超滤法 应用正压或离心力使应用正压或离心力使蛋白质溶液蛋白质

5、溶液(rngy)透透过有一定截留分子量过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液蛋白质溶液(rngy)的的目的。目的。第十一页，共84页。 超滤法超滤法 应用正压或离心力使应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定蛋白质溶液透过有一定(ydng)截留分子量的截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。质溶液的目的。第十二页，共84页。凝胶过滤凝胶过滤(gul) 是按照天然蛋白质相对分子是按照天然蛋白质相对分子(fnz)(fnz)质量大小进行分离的技质量大小进行分离的技术，又称为分子术，又称为分子(fnz)(fnz)筛层析筛层析或排阻层析。或排阻层析。 第

6、十三页，共84页。第十四页，共84页。超速离心超速离心离心（离心（centrifugation）：利用机械的快速旋）：利用机械的快速旋转所产生转所产生(chnshng)的离心力，将不同密度的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。的物质分离开来的方法。 超速离心法超速离心法 (ultracentrifugation)：60万万 g ， 6万万8万万 r/min。可用来测定。可用来测定(cdng)蛋白质分子量。蛋白质分子量。第十五页，共84页。超速离心超速离心第十六页，共84页。1.2分子分子(fnz)形状形状形状形状蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填

7、料颗粒或电泳凝胶过滤填料颗粒或电泳(din yn)凝胶中时，都会受到分子形状的影响。凝胶中时，都会受到分子形状的影响。方法方法梯度离心梯度离心电泳电泳(din yn)第十七页，共84页。1.3电荷电荷(dinh)原理原理蛋白质的净电荷与蛋白质等电点蛋白质的净电荷与蛋白质等电点pI以及以及环境环境pH值有关值有关(yugun)（pHpI，），）方法方法电泳电泳离子交换层析离子交换层析第十八页，共84页。第十九页，共84页。1.4溶解度溶解度原理原理蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。通过改变通过改

8、变pH、离子强度或加入有机试剂，、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而促进蛋白质分子的凝聚进而(jn r)形成形成沉淀。沉淀。方法：沉淀法方法：沉淀法盐析法（盐析法（eg. 硫酸铵）硫酸铵）有机溶剂沉淀法（有机溶剂沉淀法（eg. 丙酮）丙酮）等电点沉淀法等电点沉淀法第二十页，共84页。 蛋白质在高浓度中性蛋白质在高浓度中性(zhngxng)盐溶液中盐溶液中会沉淀析出，称为盐析。会沉淀析出，称为盐析。 盐析原理：盐析原理： 高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但

9、通常不会引起蛋白质引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。的变性。盐析盐析(yn x)(yn x)法法第二十一页，共84页。1.5配体特异性结合配体特异性结合(jih) 原理原理 生物生物(shngw)大分子的某些特定结构区域能大分子的某些特定结构区域能够特异性识别其他分子并可逆结合，生物够特异性识别其他分子并可逆结合，生物(shngw)分子间的这种结合能力称为亲和力。分子间的这种结合能力称为亲和力。 方法方法 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分

10、离纯化。性对另一个分子进行分离纯化。 分类分类 免疫亲和层析免疫亲和层析 生物生物(shngw)亲和层析亲和层析 金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析第二十二页，共84页。1.6吸附吸附(xf)性质性质 原理原理 蛋白质可吸附在不同材料蛋白质可吸附在不同材料(cilio)的表面，的表面，如金属、陶瓷、塑料等。如金属、陶瓷、塑料等。 方法方法 疏水层析疏水层析第二十三页，共84页。1.7变性变性(binxng)和复性和复性 原理原理 变性：蛋白质在一定变性：蛋白质在一定(ydng)的理化条件下会的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性。特性。

11、 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能。及生物学功能。 方法方法 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表达蛋白纯化原核表达蛋白第二十四页，共84页。2. 分离分离(fnl)方法方法在实验操作上，分为：在实验操作上，分为：沉淀法沉淀法离心法离心法电泳法电泳法超滤法超滤法相分配相分配(fnpi)法法层析法层析法第二十五页，共84页。第二十六页，共84页。* *不可能有一套统一的方法适用于分离不可能有一套统一的方法适用于分离(fnl)(fnl)纯化所有的蛋白质，纯化所有的蛋白质，* *但每一种

12、蛋白质可能都有一套适合的分离但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离(fnl)(fnl)纯化程序，纯化程序，* *而且所用的主要技术手段都基本相同。而且所用的主要技术手段都基本相同。Note第二十七页，共84页。二、蛋白质纯化的总原则二、蛋白质纯化的总原则(yunz)和和纯化步骤纯化步骤总原则总原则以合理的效率、速度、收率和纯度，以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他将目标蛋白从细胞的全部其他(qt)成成分，特别是从杂蛋白中分离出来，分，特别是从杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整同时仍保留其生物学活性和化学完整性。性。第二十八页，共84页。二、蛋白质纯化的总原则

13、二、蛋白质纯化的总原则(yunz)和和纯化步骤纯化步骤 步骤步骤(bzhu) 选择实验材料，实验材料预处理选择实验材料，实验材料预处理 蛋白质的提取蛋白质的提取 蛋白质的粗分级蛋白质的粗分级 蛋白质的细分级蛋白质的细分级 蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定 第二十九页，共84页。蛋白质纯化蛋白质纯化(chn hu)的前期准的前期准备备 关于蛋白质我们已知什么？关于蛋白质我们已知什么？最好的来源？最好的来源？蛋白质纯度要求？活性要求？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白的量？纯化蛋白的量？如何进行如何进行(jnxng)鉴定？鉴定？纯化时间长短？纯化时间长短？最终花费？最终花费？纯化方案？纯化方案？第三十页，

14、共84页。1、选择实验、选择实验(shyn)材料及预处理材料及预处理 选择实验材料选择实验材料 物种的选择物种的选择 组织的选择组织的选择 实验材料预处理实验材料预处理 液体材料液体材料 过滤过滤 离心离心 固体材料固体材料 洗涤：自来水洗涤：自来水蒸馏水蒸馏水提取提取(tq)缓冲液缓冲液 材料破碎：材料破碎：第三十一页，共84页。材料材料(cilio)破碎破碎 机械剪碎机械剪碎 研磨研磨 反复冻融法反复冻融法 超声破碎法超声破碎法 高压匀浆高压匀浆(yn jin)法法 酶解法酶解法第三十二页，共84页。2、蛋白质的提取、蛋白质的提取(tq) 提取分离原则提取分离原则 尽可能多地提取目的蛋白，

15、同时避免活尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失性丢失(dis)（温度过高、（温度过高、 pH、有机试、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素）剂、金属离子、蛋白酶等因素） 选择合适的选择合适的pH、选择合适的离子强度、选择合适的离子强度第三十三页，共84页。2、蛋白质的提取、蛋白质的提取(tq) 提取液成分提取液成分(chng fn)的确定的确定 pH 缓冲液：缓冲液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 柠檬柠檬酸酸-柠檬酸钠柠檬酸钠 离子：动物离子：动物 NaCl, 植物植物KCl 还原剂还原剂:DTT 蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF 金属离子螯合剂金属

16、离子螯合剂: EDTA, EGTA 去污剂去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20 甘油甘油 温度温度 04第三十四页，共84页。3、蛋白质的粗分级、蛋白质的粗分级(fn j)（粗提）（粗提） 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质。量的杂质。 常用的实验技术常用的实验技术(jsh)：沉淀法（盐析、有机：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离

17、心、透析、溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、超滤超滤第三十五页，共84页。4、蛋白质的细分级、蛋白质的细分级 粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化。状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化。 常用的实验常用的实验(shyn)技术：层析技术：层析第三十六页，共84页。4.1. 层析层析(cn x)（ chromatography ）固定固定(gdng)(gdng)相：凝胶相：凝胶流动流动(lidng)(lidng)相：缓冲液

18、相：缓冲液原理：原理：第三十七页，共84页。BioGelA agaroseBioGel P acrylamideSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose第三十八页，共84页。 层析层析(cn x)装置装置（Chromatographic equipment）蠕动泵蠕动泵层析柱层析柱检测器检测器记录仪记录仪部分部分(b (b fen)fen)收集器收集器第三十九页，共84页。 第四十页，共84页。第四十一页，共84页。4.1. 层析层析(cn x)（ c

19、hromatography ） 分子筛层析（分子筛层析（ Gel filtration ） 离子交换离子交换(l z jio hun)层析（层析（ Ion exchange ） 疏水作用层析（疏水作用层析（ Hydrophobic interaction ） 亲和层析（亲和层析（ Affinity ）第四十二页，共84页。4.1.1 分子筛层析分子筛层析(cn x) （Gel filtration） 原理原理 也称为也称为(chn wi)凝胶过滤、排阻层析。凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所流经

20、此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。分离纯化的目的。 凝胶介质凝胶介质 葡聚糖葡聚糖 （glucose） 琼脂糖琼脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（acrylamide） 纤维素（纤维素（cellulose）第四十三页，共84页。分子筛层析分子筛层析(cn x)Gel filtration chromatographyHydrophilicNo spontaneous binding to proteins.Chemically and physically stableRigid to

21、allow a high linear flow-rate亲水亲水对蛋白质亲和力低对蛋白质亲和力低物理化学性质稳定物理化学性质稳定(wndng)(wndng)流速稳定流速稳定(wndng)(wndng)第四十四页，共84页。分子筛层析分子筛层析(cn x)Gel filtration chromatography第四十五页，共84页。分子筛层析分子筛层析(cn x)Gel filtration chromatography第四十六页，共84页。分子筛层析分子筛层析(cn x)Gel filtration chromatography第四十七页，共84页。4.1.2 离子交换离子交换(l z j

22、io hun)层析层析（ Ion exchange ） 原理原理 在一定的在一定的pH条件下，不同的蛋白质带有的条件下，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。 利用利用(lyng)蛋白质和带电凝胶之间作用蛋白质和带电凝胶之间作用力的差别，把蛋白质分开的层析方法。力的差别，把蛋白质分开的层析方法。第四十八页，共84页。4.1.2 离子交换离子交换(l z jio hun)层析层析（ Ion exchange ） 种类种类 阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带阳离子交换柱：凝胶带负电

23、荷，蛋白质带正电荷正电荷 阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷负电荷 介质介质(jizh) 惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖 带电基团：羧甲基带电基团：羧甲基带负电；二乙基氨带负电；二乙基氨基基带正电带正电 平衡离子：平衡离子： 负电基团：负电基团：H+或或Na+ 正电基团：正电基团：OH-或或Cl-第四十九页，共84页。离子交换离子交换(l z jio hun)层析层析（ Ion exchange ）阳离子交阳离子交换换(jiohu(jiohun)n)：阴离子阴离子 先，阳离先，阳离子子 后后阴离子交阴离子交换换(jiohu(ji

24、ohun)n)：阳离子阳离子 先，阴离先，阴离子子 后后第五十页，共84页。4.1.3 亲和层析亲和层析（Affinity chromatography） 原理原理 利用蛋白质与配体专一性识别并结合的利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。特性而分离蛋白质的一种层析方法。 将配体固定于支持物上，当混合将配体固定于支持物上，当混合(hnh)样品流过此支持物时，只有目标蛋白能样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合。先用缓冲液洗脱杂与配体专一性结合。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。洗脱下来。第五十一页

25、，共84页。亲和层析亲和层析（Affinity chromatography）第五十二页，共84页。His-亲合示意图（金属亲合示意图（金属(jnsh)螯螯合层析）合层析） 镍柱（镍柱（Ni-NTA）第五十三页，共84页。4.1.4 疏水作用疏水作用(zuyng)层析层析 原理原理 蛋白质表面疏水基团蛋白质表面疏水基团(j tun)与与介质疏水配体的可逆相互作用介质疏水配体的可逆相互作用 方法方法 高离子强度下待分离的样品吸高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的水弱的物质先洗脱

26、，疏水强的物质后洗脱。物质后洗脱。第五十四页，共84页。4.2.电泳电泳(din yn)（ Electrophoresis ） 电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反反(xingfn)的电极移动。的电极移动。第五十五页，共84页。蛋白质常用蛋白质常用(chn yn)电泳技术电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 等电聚焦等电聚焦(jjio)电泳（电泳（ Isoelectric focusing- IEF） 双向电泳（双向电泳（ Two Dimension

27、al Electrophoresis ）第五十六页，共84页。4.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS： 1、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异 2、改变、改变(gibin)蛋白质分子构象，消除形状差蛋白质分子构象，消除形状差异异第五十七页，共84页。电泳法测目标电泳法测目标(mbio)蛋白的分子量蛋白的分子量第五十八页，共84页。4.2.2不连续不连续PAGE分离分离(fnl)蛋白质的原理蛋白质的原理 在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不同不同(b tn)的蛋白质在凝胶中能够被分离。的

28、蛋白质在凝胶中能够被分离。 原理原理 电荷效应电荷效应 浓缩效应浓缩效应 快慢离子效应快慢离子效应 凝胶浓度差效应凝胶浓度差效应 分子筛效应分子筛效应第五十九页，共84页。4.2.3 等电聚焦等电聚焦(jjio)电泳电泳（Isoelectric focusingIEF）第六十页，共84页。等电聚焦等电聚焦(jjio)（Isoelectric focusing）第六十一页，共84页。4.2.4 双向电泳双向电泳 第一向：等电聚焦第一向：等电聚焦 （pI） 第二向：第二向：SDS-PAGE (MW) 双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化链分离纯

29、化(chn hu)和鉴定的主要实验技术之和鉴定的主要实验技术之一。一。第六十二页，共84页。Isoelectric focusingSDS gel electrophoresis第六十三页，共84页。Two Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visualized第六十四页，共84页。蛋白质纯化蛋白质纯化(chn hu)策略策略方案设计篇方案设计篇 Protein purification strategy第六十五页，共84页。三、纯化三、纯化(chn hu)方案设计原则

30、方案设计原则确定纯化目标确定纯化目标purity, activity and quantity充分了解目的充分了解目的(md)蛋白及主要杂质的理化特性蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logic

31、ally第六十六页，共84页。确定确定(qudng)(qudng)纯化目标纯化目标第六十七页，共84页。三、纯化三、纯化(chn hu)方案设计原则方案设计原则确定目标确定目标purity, activity and quantity充分了解充分了解(lioji)目的蛋白及主要杂质的理化特目的蛋白及主要杂质的理化特性性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化

32、步骤尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically第六十八页，共84页。三、纯化三、纯化(chn hu)方案设计原则方案设计原则确定目标确定目标purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要充分了解目的蛋白及主要(zhyo)杂质的理化特性杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recove

33、ry and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically第六十九页，共84页。 严格依据目标蛋白质的特殊生物学性质，来设计活严格依据目标蛋白质的特殊生物学性质，来设计活性检测方案性检测方案 常见常见(chn jin)检测方法检测方法: 酶学检测酶学检测 enzymatic assays. 配体检测配体检测 ligand-binding assays 免疫检测免疫检测 immunological assays活性测定方法的要求：快

34、速活性测定方法的要求：快速(kui s)(kui s)、简便、简便、特异和定量特异和定量确定活性检测确定活性检测(jin c)(jin c)方法方法第七十页，共84页。三、纯化三、纯化(chn hu)方案设计原则方案设计原则确定目标确定目标purity, activity and quantity充分了解充分了解(lioji)目的蛋白及主要杂质的理化特目的蛋白及主要杂质的理化特性性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery

35、and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically第七十一页，共84页。尽量减少纯化尽量减少纯化(chn hu)(chn hu)步骤步骤纯化步骤纯化步骤(bzhu)(bzhu)越多，样品损失越大（产量、活性）越多，样品损失越大（产量、活性）第七十二页，共84页。 减少每步操作时间减少每步操作时间 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing rec

36、overy 减少添加物减少添加物 additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期早期(zoq)除去降解物（如蛋白酶）除去降解物（如蛋白酶） for example, proteases 每步使用不同的纯化方法每步使用不同的纯化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobici

37、ty, ligand specificity)KEEP IT SIMPLE!尽量减少纯化尽量减少纯化(chn hu)(chn hu)步骤步骤第七十三页，共84页。四、蛋白质的鉴定四、蛋白质的鉴定(jindng) 1. 浓度测定：凯氏定氮法、紫外吸收法浓度测定：凯氏定氮法、紫外吸收法 2. 纯度测定：电泳法纯度测定：电泳法 3. 特性测定：特性测定： 蛋白质分子蛋白质分子(fnz)质量与等电点的测定质量与等电点的测定 氨基酸组成及顺序分析氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析蛋白质结晶与结构分析 蛋白质活性及功能测定蛋白质活性及功能测定第七十四页，共84页。1 浓度浓度(nngd)测定测定凯氏定氮法凯氏定氮法紫外吸收紫外吸收(xshu)法法分光光度法分光光度法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法第七十五页，共84页。1 浓度浓度(nngd)测定测定凯氏定氮法：凯氏定氮法：蛋白质平均含氮量为蛋白质平