第三章 培养用液

1、 第三章第三章 培培 养养 用用 液液n 培养用液培养用液是维护组织细胞生存、生长及进是维护组织细胞生存、生长及进 行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶 液。液。n主要包括主要包括平衡盐溶液平衡盐溶液培养基培养基其他培养用液其他培养用液 天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基第一节第一节 水和平衡盐溶液水和平衡盐溶液 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。其他的杂质。 需要用需要用新鲜新鲜( (一周内）一周内）的的三蒸水三蒸水或或纯化水纯化水 纯化水的纯化水的贮存贮存对保持水的质量有很大影响：对保持水的质量

2、有很大影响：需用需用玻璃容器玻璃容器；周围环境和空气能使水污染，；周围环境和空气能使水污染，或改变其或改变其pHpH，所以要，所以要尽量减少启开的次数尽量减少启开的次数, ,避免避免和外界多接触和外界多接触, ,存放时间不宜太长存放时间不宜太长, , 最好现制现最好现制现用。用。一、细胞培养对水的要求一、细胞培养对水的要求n2 2、平衡盐溶液、平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS） 注意：注意： 配制平衡盐溶液也应当用纯化水。如果配方配制平衡盐溶液也应当用纯化水。如果配方中含有中含有Ca2+、Mg 2+，应当首先溶解这些成分。，应当首先溶解这些成分。 灭菌方法：灭菌

3、方法： 过滤除菌或高温高压灭菌。过滤除菌或高温高压灭菌。 n几种常用的平衡盐溶液：几种常用的平衡盐溶液： PBS、Hanks、D-Hanks（都有相应配方（都有相应配方, ,主要由无机盐、葡萄糖组成）主要由无机盐、葡萄糖组成） nD-Hanks与与Hanks的一个主要区别在于前者不的一个主要区别在于前者不含有含有Ca2+、Mg2+ n因此因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。常用于配制胰酶溶液。第二节第二节 培养基培养基 一、成分成分1.1.氨基酸：氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨

4、酸和缬氨酸苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸（均为型）。（均为型）。 2.2.碳水化合物：碳水化合物：葡萄糖葡萄糖3.3.维生素：维生素：叶酸、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素等。叶酸、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素等。 4.4.无机离子与微量元素：无机离子与微量元素： 钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素以及铁、锌、硒、钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素以及铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等微量元素。铜、锰、钼、钒等微量元素。 n3 3、无血清培养基、无血清培养基 不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。间生长繁殖的合成培养基。二、

5、培养基的分类：二、培养基的分类：三、如何选择培养基？三、如何选择培养基？n(1)(1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这 种细胞首选的培养基。种细胞首选的培养基。 n(2)(2)本实验室惯用的培养基本实验室惯用的培养基 n(3)(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养 基基 n(4)(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状 态，可用生长曲线、集落形成率等指标判态，可用生长曲线、集落形成率等指标判 断，根据试验结果选择最佳培养基断，根据试验结果选择最佳培养基 四、培养基的

6、配制：四、培养基的配制： （1 1）认真阅读说明书。）认真阅读说明书。 （2 2）配制时要保证充分溶解，）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨、谷氨 酰胺等物质都要在培养基完全溶解之后才酰胺等物质都要在培养基完全溶解之后才 能添加。能添加。（3 3）配制所用的水应为纯化水（三蒸水），离）配制所用的水应为纯化水（三蒸水），离 子浓度很低，水电阻达子浓度很低，水电阻达3030万万以上。以上。（4 4）所用器皿应十分洁净。）所用器皿应十分洁净。（5 5）配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于）配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于 44。DMEM培养液的配制（举例）培养液的配制（举例）n900 mL

7、 900 mL 纯化水于纯化水于1000 mL1000 mL烧杯中，将烧杯中，将DMEMDMEM粉粉1 1包倒入其中，盛粉袋用包倒入其中，盛粉袋用50 mL50 mL纯化水分次冲洗，纯化水分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。n用用5 51010的的NaHCONaHCO3 3调调pHpH至至7.27.2n加青、链霉素至终浓度加青、链霉素至终浓度100u/mL 100u/mL 和和100ug/mL100ug/mLn用容量瓶定容到用容量瓶定容到1000 mL 1000 mL n用用0.22um0.22um的滤膜过滤除菌。的滤膜过滤除菌。n分装（分装（20

8、0 mL200 mL左右）后左右）后44冰箱保存。冰箱保存。 五、血清：五、血清：n细胞在单纯的基础培养基中不能存活细胞在单纯的基础培养基中不能存活, ,基础培基础培养基中常常要添加血清，添加血清后的培养养基中常常要添加血清，添加血清后的培养基被称为基被称为“完全培养基完全培养基”。n血清终浓度多为血清终浓度多为5 5 20%20%。最常用的是。最常用的是10%10%。 n广泛应用的血清种类有广泛应用的血清种类有马血清与牛血清马血清与牛血清，后后者又分为者又分为胎牛血清、新生牛血清与小牛血清。胎牛血清、新生牛血清与小牛血清。n胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新生牛血清胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新

9、生牛血清取自出生取自出生2424小时之内的新生牛；小牛血清取小时之内的新生牛；小牛血清取自出生自出生10103030天的小牛。天的小牛。 1 1、血清的主要作用、血清的主要作用(1)(1)提供基本营养物质提供基本营养物质 (2)(2)提供贴壁和扩展因子提供贴壁和扩展因子 (3)(3)提供激素及各种生长因子提供激素及各种生长因子 (4)(4)提供结合蛋白提供结合蛋白 (5)(5)对培养中的细胞提供某些保护作用对培养中的细胞提供某些保护作用 2 2、细胞培养中使用血清的缺点、细胞培养中使用血清的缺点(1)(1)有可能改变某种细胞在体内的正常状态有可能改变某种细胞在体内的正常状态 (2)(2)血清中

10、含有一些物质对细胞会产生毒性作用血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用 (3)(3)每批血清之间都有差别每批血清之间都有差别, ,其成分不能保持一致。其成分不能保持一致。(4)(4)取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养 的细胞产生潜在影响的细胞产生潜在影响(5)(5)直接影响某些实验，如生长因子的检测直接影响某些实验，如生长因子的检测n3、血清质量的判断：、血清质量的判断： 对于使用者来说，血清质量首先从外观入手。好的血清应该对于使用者来说，血清质量首先从外观入手。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少量沉淀，比较是透明清亮，土黄色或棕黄色

11、，无沉淀或极少量沉淀，比较粘稠。粘稠。n4 4、血清的使用与储存、血清的使用与储存 (2)(2)使用前的处理：血清在使用前通常在使用前的处理：血清在使用前通常在5656加热加热3030分钟，这一过程称为分钟，这一过程称为灭活灭活。 n大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如装为小包装，如10ml10ml、20ml20ml、50ml50ml，储存于，储存于 -20-20，使用前融化。，使用前融化。n融化后的血清在融化后的血清在44不宜长时间存放，不宜长时间存放，勿超过勿超过一个月，一个月，应尽快使用。应尽快使用。 （4）血清中的沉淀物）血清中

12、的沉淀物n絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用分钟去除，也可不用处理处理n显微镜下显微镜下“小黑点小黑点”：经过热处理过的血清，沉：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象观察象“小黑点小黑点”，常误认为血清受污染。一般，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑

13、血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清的血清举例清亮清亮小黑点小黑点小黑点小黑点小黑点小黑点六、其他培养用液六、其他培养用液 n、消化液、消化液取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁的细胞从瓶壁上消化下来，悬液，传代培养时也需要将贴壁的细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有：常用的消化液有： （1 1）胰蛋白酶）胰蛋白酶(trypsin)(trypsin)溶液：溶液： 浓度一般为浓度一般为0.10.10.250.25 配制时要用配制时要用不含不含Ca2+、M

14、g2+及血清及血清的平衡盐溶液的平衡盐溶液 （2 2）EDTA溶液溶液： 使用浓度为使用浓度为0.02%0.02%；对于一些贴壁特别牢的细胞，对于一些贴壁特别牢的细胞，可可与胰酶的混合使用与胰酶的混合使用 （3 3）胶原酶）胶原酶( (collagenase) )溶液：溶液： 使用浓度为使用浓度为0.10.10.3mg0.3mgL L或或2020万万U UL L， 作用的最佳作用的最佳pHpH为为6.56.5。 胶原酶不受胶原酶不受CaCa2+2+、MgMg2+2+及血清的抑制，配制及血清的抑制，配制时可用时可用PBS。 胶原酶作用温和，不易对细胞产生损伤。在胶原酶作用温和，不易对细胞产生损伤

15、。在上皮类细胞原代培养时经常使用。上皮类细胞原代培养时经常使用。 缺点：价格昂贵缺点：价格昂贵 、谷氨酰胺补充液、谷氨酰胺补充液合成培养基中必需成分，但容易降解，所以合成培养基中必需成分，但容易降解，所以都是在使用前添加。都是在使用前添加。谷氨酰胺使用终浓度为谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L0.002mol/L。一般配。一般配制为制为100100倍浓缩液，配制时应加温至倍浓缩液，配制时应加温至3030，完全，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20-20。3 3、pHpH调整液调整液 常用的有常用的有 HEPES液液 NaHCO3 n一种弱酸，中文

16、名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性，对细胞无毒性，是一种氢离子缓冲剂，是一种氢离子缓冲剂，能较长能较长时间控制恒定的时间控制恒定的 pH 范围。范围。n使用终浓度为使用终浓度为 10-50mmol/L 10-50mmol/L n主要作用主要作用: :防止培养基防止培养基pHpH迅速变动。在开放式迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO5%CO2 2的环境，的环境，COCO2 2气体迅速逸出，气体迅速逸出，pHpH迅速升高，若迅速升高，若加了加了HEPESHEPES，此时可以维持，此时可以维持pH7.0pH7.0左右。一般左右。一般在进行克隆化培养时要添加在进行克隆化培养时要添加HEPESHEPES使用时可向使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入2ml 2ml 浓缩液，终浓度为浓缩液，终浓度为20mmol/L20mmol/L 、抗生素液、抗生素液n青、链霉素的配制及使用浓度青、链霉素的配制及使用浓度n青霉素青霉素8080万万U U加加HanksHanks液至液至80 mL80 mL，浓度，浓度1 1万万u/ u/ mL