核酸检测基本知识

1、核酸检测基本知识1 .什么是核酸检测核酸的定义：核酸是由核昔酸或脱氧核昔酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。DNAEndgroupDNA(doubktrjnded)Pho5ph>dieiterI啾蚪esPhosphitegroup核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。2 .核酸的分类核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA和核糖核酸（RNARibmrRNA手用和.BginglMtr.cdMRNA甲链3 .核酸的组成DN住口RN/W是由一个一个核昔酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、。N、P,5种元素组成。DN蹑

2、绝大多数生物的遗传物质，RN是少数不含DNA勺病毒(如HIV病毒，流感病毒，SAR病毒等)的遗传物质。RN所均长度大约为2000个核昔酸，而人的DNA是很长白1约有3X10A9个核昔酸。4 .核酸的功能在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。DNAfRN胤是核酸，它们在化学组成上有什么区别如下:DNAfRNA勺比较DNARNA主要存在邰位细胞核细胞质基本组成单位脱氧核甘酸核糖核甘酸碱基种类A、GCTA、GC、U五碳糖种类脱氧核糖核糖核昔酸链两条脱氧核甘酸链一条

3、核糖核昔酸链5.检测方法核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核酸检测。目前主要使用的方法有以下几种：a.核酸序列依赖性扩增法NASB愿由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核昔酸序列等温扩增RNA勺新技术。反应在42c进行，可在2h内将RNAI板扩增约109倍。NASBA(理是提取病毒RNA加入AM地转录酶、RNASH、T7RNAg合酶和引物进行扩增。整个反应分非循环相和循环相：在非循环相中，引物I与模板RNA1火后在AM地转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA杂合体，随即RN

4、aseH条解RNA,引物n与cDNA1火，在反转录酶作用下合成第2条DNAT补链。双链DNAT在T7RN麋合酶的作用下，经其启动子序列起动而转录RNARN双可在反转录酶的作用下反转录成DNA进入循环相，对模板进行大量扩增。b.转录介导的扩增技术TM股术原理与NASBAI本一致，略有不同之处是TM保I用的是MML逆转录酶及T7RNA1合酶两种酶，MML辿转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNASH活性。反应在41.5C进行，可在1h内将RNA!板扩增约109倍。c.连接酶酶促链式反应(LCR)LC幅基于靶分子依赖的寡核昔酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继PC丽新发展的一种较有前景的体外扩增技术。

5、它的原理就是由2段寡核昔酸单链DN麻针与目标序列杂交，当该2段DN麻针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的，中间没有核甘酸间隔，则可在连接酶作用下连接起来，连接以后的新链又可以作为模板，引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核甘酸的碱基突变，则连接反应不能发生，扩增反应终止。d.多聚酶链反应检测法(PCR)PC破术的基本原理类似于DNA勺天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。PCFfc变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA勺变性：模板DN恪加热至93c左右一定时间后，使模板DN破链或经PCIT增形成的双链DN廨离，使之成为单链，以便它与引物结合

6、，为下轮反应作准备。模板DNAI引物白退火(复性)：模板DN恪加热变性成单链后，温度降至55c左右，引物与模板DNAl链的互补序列配对结合。引物的延伸：DNA1板一引物结合物在TaqDN聚合酶的作用下，以dNT明反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成1条新的与模板DNAI互补的半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成1个循环需24min,23h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIVRNA,需要先利用逆转录反应将RNA专录为cDNA继而以cDNA?模板进行PORT增即可，这样的反应称为RT-

7、PCRe.实时荧光定量PC或术实时荧光定量PC股术，是指在PC双应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCRS程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本技术的原理是使用荧光基团标记探针，5'端标记荧光基团R,3'端标记淬灭基团Q,在没有PCRT增时，由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光；而当PCRT增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间，利用Taq酶的5'3'外切酶活性，将荧光探针水解，荧光基团被释放由来，由于在空间上与淬灭基团分开，则发由荧光。发生的荧光可以

8、被荧光探头检测到，一边扩增，一边检测，这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PC或半定量到定量的飞跃，而且与常规PCR目比，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCRf染问题等特点。f.支链DN遍测法一一bDNAbDNAi定量检测血浆中的HIV1型RNA勺一种方法。bDN幅指人工合成的带有侧链的DNAt段，在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNAI过离心从病毒颗粒中释放由来，然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA勺另一部分特异结合，又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDN麻针杂交。两套靶探针分别与病毒RNAJpol基因的不同区域特异结合。在微孔中形

9、成HIVRNAB核昔酸复合物。再加入1种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量，因为发光强度与样品中HIVRN给量成比例。bDNAF存在扩增物白勺交叉污染,这较PC幅一大进步。bDNAT数十个覆盖整个基因组的探针可以方便地检测HIV莫些变异株，但灵敏度不及PCR提高bDN展敏度是一大难点。检测步骤HIV核酸定性检测技术，具检测过程分为核酸提取、逆转录合成cDNAPCfT增反应、扩增产物定性分和结果判定和完成报告单。6.实验室检测具体步骤如下：a.核酸提取使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA寸应注意防止RN解解。DNAZ

10、置于-20C保存，RN便口需长期保存的DNAZ置于-80C保存。b.逆转录合成cDNA逆转录cDN给成反应需使用逆转录引物、dNTPs逆转录酶、RNA!抑制剂J、DTK缓冲液和适量无RNA/DN葡的超纯水以及RN版板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR-步法试剂进行第一轮扩增反应。逆转录cDN给成反应需使用逆转录引物、dNTPs逆转录酶、RN躺抑制剂、DTK缓冲液和适量无RNA/DN廨的超纯水以及RNA莫板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。使用商品化RT-PCFH步法试剂进行第一轮扩增反应。c.PCRT增反应（使用二次扩增

11、的套式PCfT增方法）PC就应需使用引物、dNTPs、DNA合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA/DNAS超纯水、以及模板（DNMcDNAo在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCRT增方法。e.扩增产物定性分析扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DN便列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。f.结果判定和完成报告单（1）实验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增由预期的片段、阴性对照没有扩增由任何片段、