槐米中芦丁的提取及含量测定

1、题目：槐米中芦丁的提取及含量测定目录摘要3关键词3前言31槐米的简介32产丁的简介41实验材料、仪器与试剂51.1实验材料51.1 实验仪器51.2 实验试剂52实验原理及实验条件52.1 实验相关原理52.2 实验条件的选择73实验方法和结果73.1 产丁的提取73.2 产丁的精制73.3 产丁的鉴定73.3.1 呈色反应73.3.2 薄层色谱检识83.4 产丁的含量测定83.4.1 对照品溶液的配制83.4.2 标准曲线的制备93.4.3 样品测定103.4.4 样品稳定性试验103.4.5 加样回收率实验104讨论与小节115参考文献116综述12槐米中芦丁的提取及含量测定摘要：目的：测

2、定槐米中产丁的含量，掌握产丁的提取工艺。方法：采用碱提酸沉法获得产丁粗提物，利用多次碱提酸沉法获得较纯的产丁，再通过显色实验以及薄层色谱鉴定槐米提取液中的产丁，并通过标准曲线法测定提取物中产丁的含量。结果：吸光度与标准溶液的浓度呈良好的线性关系，回归方程为A=30.1081C+0.0184,采样率为96%,没有太大的区别。结论：该方法易于操作，实验原理比较简单，薄层色谱与分光光度相结合实现了槐米提取液中产丁的鉴定与含量测定。关键词：槐米产丁碱提酸沉法含量测定Abstract:Objective:todeterminethecontentofludinginacaciaandtheextract

3、ionprocessofluding.Methods:alkali,acidsinkingmethodtoobtaincrudeextractrutinusingmultiplealkaliacidsinkingmethodtoobtainamorepurerutin,againthroughthecolorexperimentandTLCidentificationofrutininthesophorajaponicaextract,andthroughthestandardcurvemethodfordeterminingthecontentofrutininextracts.Result

4、s:theconcentrationofstandardsolutionandabsorbancehadgoodlinearrelationship,theregressionequationA=30.1081+0.0184C,R=0.9997,thesamplingrateis96%,notmuchdifference.Conclusion:thismethod,easytooperate,theexperimentprincipleissimple,thinlayerchromatographycombinedwithaspectrophotometKeyWords:Sophorajapo

5、nicarutinalkaliextractionandacidprecipitationcontentdetermination刖百1 .槐米的简介槐米FlosSophoraeImmaturus,是豆科植物槐树SophorajaponicaL.的干燥花蕾，微寒，现列在国家卫生部第一批药食同源名单中，有凉血止血，消肝泻火等功效1。全国大部分地方均产，主要产地在河北、天津、北京、山东、山西、辽宁等地。夏季花开放或者花蕾形成时宜采收，并及时干燥，除去枝、梗及其他杂质。开花期采栽者通常称作“槐花”，花蕾期采栽者习惯上称“槐米”。体轻，气微，味道稍微有点苦涩。我国是产丁的出口国，槐米是提取产丁的主要原

6、料，2015版中华人民共和国药典（一部）规定，槐米中总黄酮的含量（以无水产丁计）不低于20%,无水产丁（C27H0O6）不少于15%3。槐花（开花期）槐米（花蕾期）干燥槐米2 .卢丁的简介产丁（芸香甘）（Rutin）:奥皮素与芸香糖结合而成的甘。其中芸香糖（Rutinose）为葡萄糖（glucose,glc）与鼠李糖（Rhamnose,rham）经1,6-甘键连接而成的双糖。产丁具有抗炎、抗过敏、抗心肌缺氧及缺血、抗心律失常、降低血清胆固醇、抑制血小板集聚、抗溃疡、抗月中瘤、解痉、镇咳、抗病毒和增强免疫力等功能4,是预防和治疗糖尿病、心绞痛、慢性心功能不全、高血脂和预防动脉硬化心机梗死、脑血栓

7、等疾病的天然绿色药物。能皮素具有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。1 .实验材料、仪器和试剂1.1 实验材料：槐米（购于广西桂林）。1.2 实验仪器：Lambda35型紫外-可见分光光度计（PE公司）、KQ-500E型超声波清洗器、FA2004N电子天平（上海天平仪器厂）、JB202-电热恒温干燥箱（上海忠技仪器有限公司制造）、实验室真空抽滤仪YH-23（青岛仪航有限公司）、乳钵、烧杯（1000ml、500ml）、布氏漏斗、表面皿、量瓶（100ml、50ml、10ml）、10m

8、l移液管、吸量管（1ml、5ml）。1.3 实验试剂：饱和石灰水、浓盐酸、产丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100086-201755）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）、水（重蒸水）。2实验原理及实验条件2.1 .实验相关原理产丁是黄酮类化合物，其基本母核为2-苯基色原酮类化合物即C-C3-C6结构。分子式为G7H0。6,分子量为610.51,化学式见下图。淡黄色小针状结晶，熔点为174178c（含三分子结晶水），188C（无水物）。能溶于二甲基亚碉和叱噬、甲酰和碱液，微溶于乙醇；丙酮和乙酸乙酯，几乎不溶于水、氯仿、醴、苯、二硫化碳和石油醴。易溶于碱液中

9、，呈黄色。酸化后复析出，可以溶于浓硫酸和浓盐酸，呈深黄色，加水稀释复析出。稀溶液遇三氯化铁呈绿色。无气味，在光的作用下渐变暗。查阅资料可知，UV入maF0Hnm259,299(sh),359。IRVmaxKBrcm1:3400(OH,1670(C=O),1620,1520,1470(CH)。H-NMRDMSO-d6:7.52(1H,dd,J=2.0、8.0Hz);7.40(1H,d,J=2.0Hz);6.82(1H,d,J=8.0Hz);6.64(1H,d,J=2.5Hz);6.24(1H,d,J=2.5Hz);5.76(1H,d,J=7.0Hz);4.32(1H,d,J=2.3Hz);3.0

10、-4.0(10H,nj);1.08(3H,d,J=6.5Hz)0OH产丁柳皮素柳皮素，又名称精，柳皮黄素，分子式为C15HQ,分子量302,化学式见上图。黄色结晶，熔点为313-314°C(2分子结晶水)，316°C(无水物)。溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、叱噬、丙酮等溶剂，碱性水溶液呈黄色，不溶于水、苯、乙醴、氯仿、石油醴。其乙醇溶液味道极其苦涩，可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。由卢丁的化学式可知：其基本母核是平面型结构，2-位上引入的苯环与色原酮部分形成交叉共腕体系，并通过电子转移、重排，使共腕链延长，同时7-位及4/-位引入-OH或-OCH等助

11、色团后，因其促进电子移位、重排，两重作用都使产丁具有较深的颜色即淡黄色(色原酮部分原本无色)，从而使产丁易于较其他黄酮类化合物鉴别。产丁分子中含有多个酚羟基，而且7-位处于C=O的对位，4/-位处于C=C勺对位，在P-口共腕效应的影响下，使酸性较强，易溶于碱液（饱和石灰水）中，酸化后溶解度降低复析出，从而可以用于产丁的提取和精制。产丁是由奥皮素3位上的羟基与芸香糖脱水缩合成的甘，因而在酸性条件下又可以水解成柳皮素、鼠李糖、葡萄糖。产丁为黄酮甘，能与三价的铝生成黄色配合物，在NaNO勺碱性溶液中呈红色，在510nm波长处有最大吸收。根据此显色反应用分光光度法可以测定产丁，但显色反应需要具备良好的

12、重现性与灵敏性，因此必须控制反应条件，主要是溶剂种类、试剂用量、溶液酸碱度、反应时间和显色时间等。2.2 实验条件的选择最大波长的选择：将产丁对照品加硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝处理后的溶液，用紫外-分光光度计在200600nm进行扫描，标准溶液和样品溶液均在510nm处有最大吸收，故检测波长选择为5106-7。3实验方法和结果3.1 产丁的提取：采用酸提碱沉法8-11;（1）称取槐米30g,在乳钵中研碎至槐米碎裂即可，置1000ml烧杯中，加入300ml饱和石灰水（以棉花过滤至澄明）调节pH7-8之间，并且不断搅拌，加热煮沸15min,趁热以棉花过滤（过滤前应将棉花用水充分润湿，尽量赶出其中的气

13、泡）。（2）残渣再加200ml饱和石灰水，保持PH7-8之间，并不断搅拌，同时煮沸10min,趁热过滤，合并两次滤液，放冷。（3）向滤液中加入浓盐酸（边加边搅拌）调PH3-4并放置过夜。（4）次日倾出上清液（不要振摇），抽滤沉淀（布氏漏斗中垫两层滤纸）并用蒸储水洗至pH5-6,将滤得物置于表面皿上，得粗产丁。3.2 产丁的精制将粗产丁加300ml重蒸水，加热，用饱和石灰水调PH8-9,使充分溶解，趁热少量趁热抽滤，待滤液冷却后加盐酸调节PH4-5,静置，冷却，抽滤，并用蒸储水洗至PH5-6,即可得比较纯的产丁。3.3 产丁的鉴定3.3.1 呈色反应：取上述产丁提取物3-4mg,加甲醇8-10m

14、l使其溶解，分成3份做以下实验。盐酸-镁粉反应（检查是否有黄酮类化合物存在的最常用方法）：取上述溶液1-2ml,加2滴浓盐酸，再加入少量镁粉。在本实验中观察到颜色变化：黄-紫-红；说明有产丁或者柳皮素存在。皓-枸檬酸反应（区分产丁和柳皮素）：取上述溶液1-2ml,冉滴加2%ZOC2的甲醇溶液3-4滴，在本实验中观察到溶液颜色加深；再继续加入2%柠檬酸的甲醇溶液3-4滴，观察到溶液颜色稍微变浅；此步显色反应证明有产丁的存在，但无法证明是否有柳皮素存在。因产丁溶液加ZOC2后颜色加深（5-OH存在），加入柠檬酸后颜色变浅；柳皮素加ZOC2后颜色加深（5-OH3-OHC存在），加入柠檬酸后颜色变化不

15、明显，由于颜色掩盖效应，不可排除两同时存在。a-蔡酚反应（糖的检测）：取上述溶液1-2ml,然后再加10%a-茶酚乙醇溶液2-3滴，摇匀，沿管壁缓缓加入浓硫酸1ml,观察到一层出现紫红色，一层为淡黄色接近无色，说明既有产丁存在又有柳皮素存在即部分产丁水解。3.3.2 薄层色谱检识样品溶液的处理：称取产丁提取物20mg加入甲醇10ml使配制成溶液；对照品溶液的处理：取产丁对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸附剂：自制硅胶G-CMO展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水（8:1:1）薄层测定：用毛细管取供试品、对照品溶液各10L,分别点于自制的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8:

16、1:1）为展开剂，展开，一段时间后取出，再晾干，待晾干后喷三氯化铝试剂，等乙醇挥发完全后置于紫外光灯（365nn）下检视。在本实验中，观察到供试品色谱上的荧光斑点与对照品色谱的荧光斑点出现的位置相一致。从而证明了样品中产丁的存在即产丁没有全部水解。3.4 产丁的含量测定3.4.1 对照品溶液的制备精密秤取在120°C五氧化二磷减压干燥恒重控制的产丁对照品20mg至50ml容量瓶中，加适量60%醇，超声波处理使溶解，放冷，加60%醇至刻度，摇匀。精密量取25ml至50毫升容量瓶中，加60%醇至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水产丁0.2mg）。3.4.2 标准曲线的制备（1）精密量取对

17、照品溶液（0.2mg/ml）1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00分别放在25ml容量瓶中，各加入30%醇至6.0ml,各精密加入5%!硝酸钠1.0ml,充分混匀，放置6分钟。（2）各精密加入10%肖酸铝溶液0.3ml,充分摇匀，放置6分钟。（3）加入1mol/dm3氢氧化钠溶液10ml,加30*醇至刻度，摇匀，放置15分钟。（4）以相应的试剂为空白对照，在510nm最大波长处测定吸光度。以浓度为横坐标C,纵坐标为吸光度A,建立回归方程。标准溶液在紫外-分光光度计下测得的吸光度溶液浓度C（mg/ml）吸光度A0.0080.2620.0160.5020.0240.7460.0

18、320.9640.0481.4720.010.020.030.040.050.06标准溶7浓度C(mg/ml)2515A度光吸标准曲线以吸光度为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线后求线性回归方程，得回归方程：A=30.1081C+0.0184,R=0.9997。表明卢丁在0.008mg/ml0.048mg/ml范围内有良好的线性关系。3.4.3 样品测定精密称取槐米提取液（相当于含产丁0.2mg/ml）5.0ml,放在25ml容量瓶中，各加入30叱醇至6.0ml,各精密加入5%!硝酸钠1.0ml,充分混匀，放置6分钟；精密加入10%肖酸铝溶液0.3ml,充分摇匀，放置6分钟；加入1m

19、ol/dm3氢氧化钠溶液10ml,加30叱醇至刻度，摇匀，放置15分钟；于分光光度计上，在510nm波长下测定吸光度为0.1701;根据样品所测的数据，由回归方程计算出样品溶液中产丁的含量为0.00504mg/ml;则无水产丁（）=标准曲线上读出的浓度（mg/ml）*25ml/取样量（ml）*样品的标识浓度(mg/ml)=21%3.4.4 样品稳定性试验精密量取上述配制成的产丁甲醇溶液(0.2mg/ml),即刻在510nm处测定吸光度，在常温避免阳光直接照射条件下，每间隔一个小时测量一次，依次为1h、2h、3h、4h、5h,8h再次测定；结果表明，吸光度值在8h内保持稳定(如下图)。时间012

20、345678(h)吸光6.04006.04026.04016.04036.03996.03986.04006.03986.0400度(A)3.4.5加样回收率实验(1)将经粉碎(过20目筛)的槐米样品称0.3g,每份加入10mg产丁标准品到50毫升烧杯中；(2)加入3ml石油醴浸泡10min后，超声处理30min,静置，待分层后，仔细地将石油醴层倒出；(3)再次加入3ml石油醴，浸泡10min后，超声处理30min,仔细地将石油醴层倒出，避免粉末层倒出，记录实验现象；(4)经脱脂的药材加60叱醇30ml,用球形冷凝管加热回流过滤半个小时，分别用60叱醇5ml洗涤2次获得醇液；(5)将醇液倒入5

21、0ml容量瓶并用60叱醇定容。(6)精密吸取样品溶液0.8ml于25ml容量瓶中，力口30叱醇至6.0ml,加入5%!硝酸钠1.0ml,混匀，放置6分钟。(7)力口10%肖酸铝溶液1.0ml,摇匀，放置6分钟。(8)加入1mol/dm3氢氧化钠溶液10ml,加30无醇至刻度，摇匀，放置15min。(9)以相应的试剂为空白，在510nm最大波长处测定样品平均吸光度为0.319.(10)根据回归方程，计算加样回收率=(加标试样测定值-试样测定值)+加标量X100%.=(60.30-50.70)10=96%,符合加样回收率范围。4 .讨论与小节中国药典(2015年版)采用比色法测定产丁的含量，此法比

22、较复杂。本实验采用紫外-分光光度法，重现性好，精密度高，操作简便，易于实践。同时本实验也结合了产丁的性质以及前人的实践经验，根据卢丁在冷热水中溶解度的差异以及在不同温度、酸碱度等条件下水解程度的差异，采取了碱提酸沉法。测得槐米中产丁含量为21%,表明了本实验的可行性。5 .参考文献1杨娜，朱开梅，顾生玖.从槐米中提取柳皮素方法的研究进展J.时珍国医国药，2015,21(12):3340.2李锋，唐辉，韦宵等.广西全州县金槐生产存在的问题及发展对策J.广西科学院学报，2009,25(2):130-134.3国家药典委员会.中国药典S.北京：中国医药科技出版社，2015:333.4李茂星，谢景文，

23、葛欣.卢丁的药效学研究进展J.华西药学杂志，2011,15(6):450.5 OdettiPR,BorgoglioA,PascaleAD,etal.Preventionofdiabetes一increasedagingeffectonratcollagenlinkedfluorescencebyaminoguanidineandrutinJ.Diabetes,1990,39(7):7966李振志，朱华，谢锋等.不同产地槐米中产丁的含量测定J.WorldChineseMedicine,2013,8(8):952-954.7王朝周,程秀民.薄层扫描法测定槐米中产丁含量J.中国方剂学实验杂志，200

24、4,10(4):21-22.8冀德富，程月召，李慧峰等，高纯度产丁的制备实验研究J.实验室科学，2014,17(4):38-41.9李颖平，用碱溶酸沉法从槐米中提取产丁工艺的优化J.山西农业科学，2015,43(6):751-753.10李慧，王明明，槐米中产丁的提取结晶与含量测定J.陕西中医,2011,32(10):1412-1413.11姚倩，郭晓强，宋芹，槐米中产丁提取工艺的比较研究J.成都大学学报(自然科学版)，2013,32(4):332-333.综述芦丁的药理作用及剂型的研究进展摘要：在我国产丁产量比较大，槐米、养麦、红旱莲、野生梧桐叶等植物中含有产丁，因而目前多通过提取纯化的方法

25、生产产丁，也有部分通过人工合成。近年来，人们对于卢丁的研究越来越深入，产丁在医药中的应用也越来越频繁。该综述主要总结前人对卢丁在药理及剂型方面的部分研究。关键词：产丁药理作用剂型研究进展Abstract:Rutinyieldinourcountryislarger,sophorajaponica,buckwheat,reddrylotus,wildwutongleaves,suchasplantcontainsrutin,moresonowmanufacturedbythemethodofextractionandpurification,rutinandsomebyartificialsyn

26、thesis.Inrecentyears,thestudyofludinghasbecomemoreandmoreadvanced,andtheuseoflutininmedicinehasbecomemoreandmorefrequenThisreviewmainlysummarizessomeresearchonthepharmacologicalanddosageformsofluding.Keywords:rutinPharmacologicaleffectsDosageformsTheresearchprogress产丁，异名芸香甘、维生素P、紫柳皮甘，芸香叶甘，路丁，络通10具有维

27、生素P样作用，能降低血管脆性及异常的通透性，可用于防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂。多年来，国内外学者借助于现代先进的化学和药理手段，尤其是新型的分离和分析方法，对产丁的药理活性进行了深入的研究。本文着重就产丁的药理作用、主要剂型和临床应用进行综述。1 .芦丁的药理作用1.1 对心血管系统的作用目前，有不少含黄酮类化合物的中药在临床上用于治疗冠心病，其中产丁、柳皮素等有明显的扩冠作用，同时对由ADP胶原蛋白或凝血酶引起的血小板聚集及血栓的形成也有抑制作用。储金秀等2研究表明产丁能剂量依赖性的抑制AngR诱导的心肌细胞的肥大，并能拮抗Angll诱导的心肌细胞蛋白激酶C（proteinkinase

28、C,PKC）蛋白表达的增加和位移，降低PKC的活性。PKC主要存在于细胞核内，对细胞增殖、分化、转化、凋亡信号转导发挥重要作用，与心血管疾病关系密切。在抑制血小板凝聚方面，可能与产丁可以抑制血小板激活因子（PAF诱导的血小板聚集、5-HT释放及血小板游离钙增加有关。PAF是迄今发现的最强的血小板聚集激活剂，它可由血小板、白细胞、内皮细胞等多种细胞产生并具有广泛的生物活性，在许多疾病过程中起介导作用，与组织缺血再灌注损伤、冠心病、动脉粥样硬化、脑血管疾病等诸多心脑血管疾病密切相关冏。因此拮抗PAF的作用，为目前缓解缺血性心脑血管疾病的重要途径。1.2 抗炎作用有报道，产丁及其衍生物羟乙基产丁（曲

29、克产丁）对角叉菜胶、5-HT及PEGi秀发的大鼠足爪水月中、甲醇引发的关节炎及棉球肉芽月中等均有明显的抑制作用。产丁抗炎的机制可能与前列腺素生物合成过程中的脂氧合酶受到抑制有关。1.3 抗菌及抗病毒作用有研究表明：产丁有抗病毒和抑制醛糖还原酶活性的作用网，此机制尚不明确。1.4 弱雌性激素样作用有报道称，异黄酮类有雌性激素样作用；而产丁等黄酮类有弱雌性激素样作用,这可能是它们与己烯雌酚结构相似的缘故。1.5 抗自由基活性、防晒、抗氧化产丁是消除自由基的强氧化剂,它可终止自由基的连锁反应,抑制生物膜上多不饱和合脂肪酸的过氧化作用，消除脂质过氧化产物，保护生物膜及亚细胞结构的完整性，在机体内起着重

30、要作用60产丁是一种天然抗氧化剂，研究发现产丁对O2有很强的清除作用，清除效率可达96%Z上。1.6 抗脂质过氧化作用脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而引起的一系列氧化过程。产丁作为二价铁的螯合剂，能抑制Fenton（芬顿）反应和脂质过氧化的链式反应而具有明显的抗脂质过氧化作用7,其保护作用与传统的谷胱甘肽（GSH保护作用近似。1.7 抗急性胰腺炎（AP）产丁能有效防止低钙血症的发生，并降低胰腺组织钙离子浓度。研究发现产丁能提高胰腺组织大鼠磷脂酶含量，提示产丁可能对胰腺组织PLA2的释放及激活具有抑制作用；产丁能有效防止AP大鼠低钙血症的发生，可能是通过阻止钙离子内流并降低

31、胰腺组织细胞钙离子超载，而减轻对AP的病理生理损害网。1.8 增强免疫、抗衰老有报道表明，产丁可减小血管通透性，增加弹性，抑制毛细血管扩张，从而起到祛红血丝的作用；同时产丁还具有抗辐射和吸收X射线的功能，使皮肤红润、光滑、抗皱，起到延缓衰老的作用。1.9 降低血糖、抗癌细胞产丁可激活神经介素受体，神经介素U2是2000年发现的一种亚型神经受体，神经介素U2受体的激活可调节饮食，增强胰岛素敏感性，降低血糖%同时产丁能抑制结肠癌细胞和前列腺癌细胞的增殖。2 .芦丁的主要剂型的研究进展根据卢丁的物理性质，产丁难以溶于水，易溶于碱液。产丁口服难以吸收完全，生物利用度低，故产丁的剂型研究有很大的发展前景

32、。2.1 产丁固体分散体系固体分散体是指药物与载体混合制成的高度分散的固体分散剂。它可以利用不同性质的载体达到速效、缓释、控释的目的。产丁固体分散体系可使难溶性药物在水溶性载体中形成分子分散体系，从而改善药物的溶解性能，加快溶出速度，提高生物利用度，实现药物高效、速效、长效化，也可控制药物靶向释放，增加药物稳定性，避免药物氧化、水解等。2.2 产丁控释片控释片是药物能在预定的时间内自动以预定的速度释放，使血药浓度长时间恒定维持在有效浓度范围的制剂。药物以受控的形式恒速（以零级或接近零级速率）释放或者被控制在作用器官等特定吸收部位释放。产丁控制片能使产丁的血药浓度在短时间在特定部位富集，从而提高生物利用度。2.3 产丁共沉淀物将产丁与亲水性载体制成共沉淀物，可以改善产丁的溶解性，从而提高生物利用度。2.4 产丁泡腾颗粒泡腾片剂是近年来国外开发应用的一种新颖片剂，当泡腾片放入饮水中之后，在泡腾崩解剂的作用下，即刻产生大量气泡（二氧化碳），使片剂迅速崩解和融化，有时崩解产生的气泡还会使药片在水中上下翻滚，加速其崩解和融化。片剂崩解时产生的二氧化碳部分溶解于饮水中，使饮水喝