王镜岩-生物化学I-第5章 蛋白质的共价结构—第6章 蛋白质结构与功能的关系

1、第五章蛋白质的共价结构 1952年丹麦人年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次的结构可以分成四个层次: 一级结构：一级结构： 二二级结构：级结构： 三三级结构：级结构： 四四级结构：级结构： 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次蛋白质结构层次肽基

2、的肽基的C、O和和N原子间的共振相互作用原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：共振产生的重要结果： 限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面形成酰胺平面 产生键的平均化产生键的平均化 肽键呈反式构型肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体共振杂化体 最小的蛋白质，由最小的蛋白质，由A链链(21 AA)和和B (30 AA)组成；动物胰腺组成；动物胰腺细胞分泌的一种激细胞分泌的一种激素素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+； 1921年年Banting & Best 从胰腺中抽提从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，出了有活性的胰岛素，1923年年

3、Banting & Macleod获获Nobel医学奖；医学奖； 194353年，年，Sanger确定了牛胰岛素确定了牛胰岛素的一级结构，的一级结构，1958年获得年获得Nobel化学奖；化学奖； 1981年，年，Berg（因因DNA重组技术得奖）重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素在大肠杆菌中表达了人胰岛素.蛋白质一级结构测定的步骤蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化、蛋白质的分离纯化、测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目3、亚基分离亚基分离4、二硫键的拆分与保护二硫键的拆分与保护5、分析每一多肽链的氨基酸组成分析每一多肽链的氨基酸组成6、鉴定鉴定多肽链的多肽

4、链的N-末端和末端和C-末端残基末端残基7 、多种方法的部分水解多种方法的部分水解8、测序测序 9、重叠重叠10 、二硫键位置的确定二硫键位置的确定一级结构测定策略蛋白质一级结构测定步骤氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯( (DNFB)DNFB)的反应的反应（sangersanger反应）反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色黄色)+ HF弱碱中弱碱中氨基酸氨基酸SangerSanger试剂试剂( (FDNB)FDNB)标记标记N N末端末端Sanger试剂标记反应ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A

5、,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 结论结论：A B C D ESanger试剂标记测序H2NCHCOOH + RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=OHNCHCOOH RDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高酰化反应氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应的反应（EdmanEdman反应）反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydan

6、tion-AA）弱硷中弱硷中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+Edman 降解法降解法(I)DABITC DABITC ：有色有色EdmanEdman试剂试剂在在EdmanEdman试剂上加发色基团试剂上加发色基团Edman降解法1Edman 降解法降解法(II)Edman降解法2 瑞典人瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19 1946-47年在美国留学时想到改进年在美国留学时想到改进1930 年年Abderhalden & Brockmann发明的发明的 PITC试剂的反应试剂的反应, 50年发明年发明Edman degradation反应反应. 1957年移居墨尔

7、本年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始远离国际学术中心开始 过隐居生活过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸的速度氨基酸的速度; 他坚持不申请专利他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开给了美国公司得以随便开发仪器的方便发仪器的方便. 1972年到德国年到德国,77年因脑瘤过世年因脑瘤过世. 由于由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测降解产物需要在紫外域进行检测, 只有只有HPLC和和相应的紫外检测手段进步后才得到普及相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期年代后期Moore & Stein利用该反应测定了利用该反应测定

8、了RNase的一级结构的一级结构, 遗憾的是遗憾的是Edman没有和他们分享没有和他们分享Nobel化学奖化学奖. + + + 肼肼法测定法测定肼法C端测定 利用外切蛋白水解酶利用外切蛋白水解酶 () 将肽链的氨基酸从将肽链的氨基酸从N端端 ()或或C端端 () 一个接一个游一个接一个游离出来，离出来， 在不同时间取样进行分析，根在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序断氨基酸的排列顺序。酶解法末端测序酶解法末端测序酶解法末端测序肽键的专一性水解肽键的专一性水解( (化学法化学法) )化学法化学法: CNBr, H+, N

9、H2OH, etc化学法专一性水解消化道内几种蛋白酶的专一性消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe. Trp）胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsin）；）；胰糜乳蛋白酶（胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；）；嗜热菌蛋白酶（嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；）；木瓜蛋白酶（木瓜蛋白酶（papain）；）；胃蛋白酶（胃蛋白酶（pepsin）；）；枯草杆菌碱性蛋白酶（枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）肽键的专一性

10、水解肽键的专一性水解( (酶法酶法) )酶法专一性水解太短在多肽链中次序的决定 资料：N-末端残基H,C-末端残基S; 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO 借助重叠肽确定肽段次序： 末端残基 H S 末端肽段HOWT APS 或 OUS 第一套肽段：HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段：HO WTOU SEO VERL APS 推断全序列: HOWTOUSEOVERLAPS二硫键的断裂：二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，

11、使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。胰岛素胰岛素 -巯基乙醇巯基乙醇碘乙酸碘乙酸二二硫硫键键的的断断裂裂确定原多肽链重二硫键的位置：确定原多肽链重二硫键的位置： 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。二硫键的切割与保护二硫键的切割与保护二硫键的保护1、为防止、为防止跟跟发生交换反发生交换反应，先将自由应，先将自由SH基封闭基

12、封闭;2、进行专一性部分水解、进行专一性部分水解;3、纸层析分离水解产物、纸层析分离水解产物;4、气相过甲酸法切断、气相过甲酸法切断键，作第二键，作第二相纸层析相纸层析;5、将迁移率发生变化的多肽进行测序、将迁移率发生变化的多肽进行测序经典的二硫键位置的确定法经典的二硫键位置的确定法二硫键位置确定对角线电泳示意图对角线电泳示意图末端测序的用途常利用蛋白质数据库常利用蛋白质数据库蛋白质氨基酸顺序与生物功能蛋白质氨基酸顺序与生物功能研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。 进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及

13、切割实验等。 例例1 镰刀形贫血病镰刀形贫血病l患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S）l它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于链的N-末端第6位残基发生了变化l（Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基l使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血l这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性蛋白质一级结构的个体差异蛋白质一级结构的个体差异例例2 一级结构的局部断裂与蛋白质的一级结构的局部断裂与蛋白质的激活激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性

14、分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.例例3 同源蛋白同源蛋白 同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素Cl60 个物种中，有 28个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发

15、挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.l可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.黄色： 不变残基（invariable residues）蓝色 ： 保守氨基酸（conservative residues）未标记：可变残基（variable residues）不不同同生生物物来来源源的的细细胞胞色色素素c c中中不不变变的的AAAA残残基基细胞色素细胞色素c c分子的空间结构分子的空间结构不变不变的的AAAA残基残基 28个不变的个不变的AA残基，是残基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所

16、不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与可能参与电子传递；有的可能参与“识别识别”并结合并结合细胞色素还原酶和氧化酶。细胞色素还原酶和氧化酶。1410610013432302918176759525148454138848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgGlyCysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素血红素不同生物与人的不同生物与人的CytcCytc的的AAAA差

17、异数目差异数目生物生物 与人不同的与人不同的AAAA数目数目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 第第6章章 蛋白质结构与蛋白质结构与 功能的关系功能的关系一、肌红蛋白的结构与功能一、肌红蛋白的结构与功能二、血红蛋白的结构与功能二、血红蛋白的结构与功能三、血红蛋白分子病三、血红蛋白分子病四、四、免疫系统和免疫系统和免疫球蛋白免疫球蛋白五、肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩五

18、、肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩六、蛋白质的结构与功能进化六、蛋白质的结构与功能进化(The relation between structure and function of proteins)一、肌红蛋白的结构与功能一、肌红蛋白的结构与功能肌红蛋白肌红蛋白 肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin，Mb）主要存在于）主要存在于肌肉中，是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和肌肉中，是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。肌红蛋白由一条多肽链和一分配氧的蛋白质。肌红蛋白由一条多肽链和一个辅基血红素（个辅基血红素（heme）构成，相对分子量）构成，相对分子量16700，含含153个氨基酸残基

19、。除去血红素后仅剩下的肽个氨基酸残基。除去血红素后仅剩下的肽链部分称为珠蛋白（链部分称为珠蛋白（globin），它和血红蛋白的），它和血红蛋白的、亚基有明显的同源性，它们的构象和功亚基有明显的同源性，它们的构象和功能也极为相似。血红素非共价地结合在珠蛋白能也极为相似。血红素非共价地结合在珠蛋白的疏水空穴中。的疏水空穴中。 肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构myoglobin辅基血红素辅基血红素 血红素由原卟啉血红素由原卟啉（protoporphyrin ）中）中间结合一个间结合一个Fe原子构成，原卟啉原子构成，原卟啉是由是由4个吡咯个吡咯环通过甲叉桥连接而成的扁平环状化合物。卟啉环通过甲叉桥连接而成

20、的扁平环状化合物。卟啉环中央结合环中央结合Fe原子，原子，Fe原子通常是八面体配位，原子通常是八面体配位，应该有应该有6个配位键，其中个配位键，其中4个配位键与个配位键与4个吡咯环个吡咯环的的N原子相连，另两个配位键分布在卟啉环的上原子相连，另两个配位键分布在卟啉环的上下。下。Fe原子可以是二价的或三价的，相应的血红原子可以是二价的或三价的，相应的血红素称为素称为亚铁亚铁血红素（血红素（ferroheme，heme）和高铁）和高铁血红素（血红素（ferriheme，hematin），相应的肌红蛋），相应的肌红蛋白称为白称为亚铁亚铁肌红蛋白（肌红蛋白（ferromyoglobin）和高铁）和高铁

21、肌红蛋白（肌红蛋白（ferrimyoglobin，metmyoglobin）。）。 肌红蛋白的辅基血红素肌红蛋白的辅基血红素hemeprotoporphyrin O2与肌红蛋白的结合与肌红蛋白的结合 血红素中的铁的第血红素中的铁的第5个配位键与珠蛋白的第个配位键与珠蛋白的第93（或（或F8）位）位His残基的咪唑基残基的咪唑基N结合，这个结合，这个His称称为近侧为近侧His，而，而O2与与Fe的第的第6个配位键结合。在肌个配位键结合。在肌红蛋白没有结合红蛋白没有结合O2时，这个部位是空的。高铁肌时，这个部位是空的。高铁肌红蛋白不能与红蛋白不能与O2结合，结合，H2O分子代替分子代替O2成为第

22、成为第6个个配体。配体。 在血红素结合在血红素结合O2的一侧，还有一个的一侧，还有一个His残基，残基，即第即第64（或（或E7）位）位His残基，称为远侧残基，称为远侧His。由于。由于这个远侧这个远侧His的存在，使得的存在，使得O2的结合受到空间位阻。的结合受到空间位阻。在氧合肌红蛋白中，在氧合肌红蛋白中， O2的两个原子与的两个原子与Fe不成一条不成一条直线，而是倾斜了直线，而是倾斜了30。氧合肌红蛋白中血红素铁离子的6个配体近侧近侧His远侧远侧HisCO的毒性作用 第第6个配位位置的空间位阻很重要。游离在溶个配位位置的空间位阻很重要。游离在溶液中的铁卟啉结合液中的铁卟啉结合CO的能

23、力比结合的能力比结合O2强强25000倍，倍，但在肌红蛋白中，血红素对但在肌红蛋白中，血红素对CO的亲和力仅比对的亲和力仅比对O2的亲和力大的亲和力大250倍。肌红蛋白（还有血红蛋白）降倍。肌红蛋白（还有血红蛋白）降低对低对CO的亲和力，可以有效地防止代谢过程中产的亲和力，可以有效地防止代谢过程中产生的少量生的少量CO占据它们的占据它们的O2结合部位。尽管如此，结合部位。尽管如此，当空气中当空气中CO的含量达到的含量达到0.06%0.08%即有中毒即有中毒的危险，达到的危险，达到0.1%则会导致死亡。则会导致死亡。 O2和和CO与肌红蛋白血红素与肌红蛋白血红素Fe（）的结合的结合Free he

24、mewith imidazoleMb:CO Complex Oxymyoglobin肌红蛋白的蛋白质部分的作用 通常情况下，通常情况下，O2分子与分子与Fe（）紧密接触）紧密接触会使会使Fe（）氧化成）氧化成Fe（），溶液中游离的），溶液中游离的亚铁血红素很容易被氧化成高铁血红素，但在亚铁血红素很容易被氧化成高铁血红素，但在肌红蛋白中，由于血红素处于疏水环境中，血肌红蛋白中，由于血红素处于疏水环境中，血红素红素Fe（）不容易被氧化。）不容易被氧化。 同样是血红素，与不同的蛋白质结合后，具同样是血红素，与不同的蛋白质结合后，具有不同的功能，如在细胞色素有不同的功能，如在细胞色素C中，血红素起中，

25、血红素起可逆电子载体的作用，过氧化氢酶中，血红素可逆电子载体的作用，过氧化氢酶中，血红素催化催化H2O2歧化成歧化成H2O和和O2 。肌红蛋白血红素肌红蛋白血红素Fe原子的位移原子的位移 肌红蛋白血红素在没有与肌红蛋白血红素在没有与O2结合时，铁原结合时，铁原子是向第子是向第 5 配位体方向（配位体方向（His F8）突出的。当）突出的。当与与O2结合时，铁原子被拉回到卟啉平面。结合时，铁原子被拉回到卟啉平面。 肌红蛋白血红素Fe原子的位移肌红蛋白结合氧的定量分析肌红蛋白结合氧的定量分析2MbO2OMb 22MbOOMbK 22MbMbOMbOY肌红蛋白与肌红蛋白与O2结合的反应式为结合的反应

26、式为其解离常数为其解离常数为K , 令令Y 为肌红蛋白的氧饱和分数，即为肌红蛋白的氧饱和分数，即将将改写为改写为KOMbMbO22肌红蛋白结合氧的定量分析肌红蛋白结合氧的定量分析将将代入代入得得 ， 22MbKOMbKOMbY122KOKOYKOOY22 根据根据henry定律，溶于液体的任一种气体的浓度定律，溶于液体的任一种气体的浓度与液体上面的该气体的分压成正比，即与液体上面的该气体的分压成正比，即 O2= = A p (O2) 式中式中A 为比例系数，为比例系数，p (O2)为氧气的分压。为氧气的分压。 肌红蛋白结合氧的定量分析肌红蛋白结合氧的定量分析将将代入代入得得KOpAOpAY)(

27、)(22AKOpOpY)()(22KOpOpY)()(22肌红蛋白的氧结合曲线肌红蛋白的氧结合曲线 实验中实验中 p (O2) 可以测得，氧分压可以测得，氧分压常用常用Torr为为单位。单位。Y 值可用分光光度法测定，因为肌红蛋白值可用分光光度法测定，因为肌红蛋白结合了结合了O2 时会引起吸收光谱的改变。时会引起吸收光谱的改变。Y 对对 p (O2) 作图所得的曲线称为氧结合曲线。作图所得的曲线称为氧结合曲线。 1 Torr = 133 Pa = 1 mmHg 肌红蛋白的氧结合曲线肌红蛋白的氧结合曲线KOpOpY)()(22双曲线方程双曲线方程Hill作图 为氧结合肌红蛋白的分数与没有结合为氧

28、结合肌红蛋白的分数与没有结合氧的肌红蛋白的分数之比。氧的肌红蛋白的分数之比。 YY1KOpOpKOpOpKOpOpKOpOpYY)()()()()()(1)()(122222222两边取对数得两边取对数得 KOpYY)(lg)1lg(2KOpYYlg)(lg)1lg(2Hill作图 以以 对对 作图作图称为称为Hill作图，肌红作图，肌红蛋白的蛋白的Hill图是一条直线。当图是一条直线。当 时（时（50%的肌红的肌红蛋白结合了氧），蛋白结合了氧）， ，这时，这时 ，这一点的斜率称为这一点的斜率称为Hill系数，肌红蛋白的系数，肌红蛋白的Hill系数等系数等于于1，说明，说明O2分子彼此独立地与

29、肌红蛋白结合分子彼此独立地与肌红蛋白结合。 )1lg(YY)(lg2Op11YY0)1lg(YY502)(PKOp氧与肌红蛋白结合的氧与肌红蛋白结合的Hill图图肌红蛋白的贮氧和输氧作用 线粒体中氧浓度线粒体中氧浓度为为010 torr，静脉血氧浓度为，静脉血氧浓度为15 torr或更高些。肌红蛋白的或更高些。肌红蛋白的P 50为为2 torr，所以在，所以在大多数情况下，肌红蛋白是高度氧合的，是氧的贮大多数情况下，肌红蛋白是高度氧合的，是氧的贮存库。如果由于肌肉收缩使线粒体中氧含量下降，存库。如果由于肌肉收缩使线粒体中氧含量下降，它就可以立即供应氧。它就可以立即供应氧。肌红蛋白的贮氧和输氧作

30、用 肌红蛋白也有利于细胞内氧从细胞的内表面向肌红蛋白也有利于细胞内氧从细胞的内表面向线粒体转运，因为这种运转是顺浓度梯度的，细胞线粒体转运，因为这种运转是顺浓度梯度的，细胞内表面的氧浓度约为内表面的氧浓度约为10 torr（肌红蛋白的氧饱和度（肌红蛋白的氧饱和度约为约为80%），而线粒体内的氧浓度约为），而线粒体内的氧浓度约为1 torr（肌红（肌红蛋白的氧饱和度约为蛋白的氧饱和度约为25%），肌红蛋白可以从细胞），肌红蛋白可以从细胞内表面结合氧，而运到线粒体内表面结合氧，而运到线粒体中释放氧。中释放氧。 二、血红蛋白的结构与功能二、血红蛋白的结构与功能血红蛋白血红蛋白 血红蛋白（血红蛋白（h

31、emoglobin，Hb）存在于红）存在于红细胞中，它的主要功能是在血液中结合并转细胞中，它的主要功能是在血液中结合并转运氧气，它在肺中与氧气结合，运输到全身运氧气，它在肺中与氧气结合，运输到全身各处组织中，再释放出氧气。各处组织中，再释放出氧气。 人体内有正常功能的血红蛋白人体内有正常功能的血红蛋白 血红蛋白的氨基酸组成血红蛋白的氨基酸组成 链或链或样链样链由由141个氨基酸残基组成，个氨基酸残基组成，链或链或样链由样链由146个氨基酸残基组成，而肌红蛋个氨基酸残基组成，而肌红蛋白的肽链由白的肽链由153个个氨基酸残基组成，它们都叫珠氨基酸残基组成，它们都叫珠蛋白。同一类型不同希腊字母代表的

32、链有个别蛋白。同一类型不同希腊字母代表的链有个别氨基酸残基不同。氨基酸残基不同。 血红蛋白的三维结构血红蛋白的三维结构11221122Hb的的链、链、链和链和Mb链构链构象的相似性象的相似性 血红蛋白血红蛋白链、链、链及肌红蛋白链的三级结链及肌红蛋白链的三级结构非常相似，但这三种肽链的氨基酸序列有很大构非常相似，但这三种肽链的氨基酸序列有很大不同，不同，141个氨基酸残基位置中只有个氨基酸残基位置中只有27个位置的残个位置的残基在这三种肽链中是相同的。基在这三种肽链中是相同的。 Mb Hb Hb不同物种血红蛋白氨基酸不同物种血红蛋白氨基酸序列的比较序列的比较 比较了多种（从七腮鳗到人）不同的血

33、红蛋比较了多种（从七腮鳗到人）不同的血红蛋白的氨基酸序列，证明序列中有白的氨基酸序列，证明序列中有9个位置的残基个位置的残基是所有研究过的血红蛋白所共有的，这些称为高是所有研究过的血红蛋白所共有的，这些称为高度保守的残基。度保守的残基。 血红蛋白内部的非极性残基可以换成另一种血红蛋白内部的非极性残基可以换成另一种非极性残基而功能不变。非极性残基而功能不变。 血红蛋白氧合时亚基的移动血红蛋白氧合时亚基的移动 血红蛋白分子中，血红蛋白分子中，亚基的接触有两类，一亚基的接触有两类，一类是类是1 11 1接触和接触和2 22 2接触，这类接触称为装配接触，这类接触称为装配接触；另一类是接触；另一类是1

34、 12 2接触和接触和2 21 1接触，这类接接触，这类接触称为滑动接触。氧合时，每个触称为滑动接触。氧合时，每个二聚体半分子二聚体半分子作为一个刚体移动，这两个二聚体彼此滑动。我们作为一个刚体移动，这两个二聚体彼此滑动。我们将其中一个二聚体看作不动，另一个二聚体将绕一将其中一个二聚体看作不动，另一个二聚体将绕一个设想的偏心轴个设想的偏心轴旋转旋转15，并平移，并平移0.08nm。 血红蛋白氧合时亚基的移动血红蛋白氧合时亚基的移动 去氧血红蛋白去氧血红蛋白 1111的移动过程的移动过程 氧合血红蛋白氧合血红蛋白血红蛋白氧合时铁原子的移动 在去氧血红蛋白中，铁在去氧血红蛋白中，铁原子向近侧原子向

35、近侧His方向凸方向凸起约起约0.06nm。氧合时，铁原子的体积缩小，向卟。氧合时，铁原子的体积缩小，向卟啉环平面靠近约啉环平面靠近约0.039nm，并牵拉近侧，并牵拉近侧His往血红往血红素平面移动，这些移动，传递到亚基的界面，使素平面移动，这些移动，传递到亚基的界面，使得亚基间的相互得亚基间的相互位置发生变化。位置发生变化。 血红蛋白氧合时铁原子的移动 血红蛋白的两种构象态血红蛋白的两种构象态 血红蛋白有两种主要构象态，血红蛋白有两种主要构象态，一种是一种是T态即紧张态即紧张态（态（tense state），另一种是），另一种是R态即松弛态（态即松弛态（relaxed state）。）。O

36、2对对R态的亲和力明显地高于对态的亲和力明显地高于对T态的亲和态的亲和力，并且力，并且O2的结合更稳定了的结合更稳定了R态。缺氧时态。缺氧时T态更加稳态更加稳定，因此定，因此T态是去氧血红蛋白的主要构象，态是去氧血红蛋白的主要构象，R态是氧态是氧合血红蛋白的主要构象。合血红蛋白的主要构象。T态血红蛋白结合态血红蛋白结合O2后转后转变成变成R态态，并使得分子内一些盐桥断裂。，并使得分子内一些盐桥断裂。 去氧血红蛋白中去氧血红蛋白中各亚基间的盐桥各亚基间的盐桥血红蛋白的别构效应血红蛋白的别构效应 血红蛋白是一个四聚体蛋白，它与肌红蛋白血红蛋白是一个四聚体蛋白，它与肌红蛋白相比，出现了一些新的性质。

37、血红蛋白的氧合具相比，出现了一些新的性质。血红蛋白的氧合具有正协同同促效应，即一个有正协同同促效应，即一个O2的结合促进同一分的结合促进同一分子其它亚基与子其它亚基与O2的结合。具有这种性质的蛋白质的结合。具有这种性质的蛋白质称为别构蛋白（其它蛋白质也有负协同效应的）。称为别构蛋白（其它蛋白质也有负协同效应的）。 血红蛋白的协同性氧结合血红蛋白的协同性氧结合24OHb 42)(OHb)(4242OHbOHbK KOpOpY)()(2424 假设假设O2与与Hb的结合是一种的结合是一种“全或无全或无”的方式，的方式，其结合反应式为其结合反应式为则解离常数则解离常数K 为为 按照前面肌红蛋白结合按

38、照前面肌红蛋白结合O2的定量分析的推导的定量分析的推导方法，方法，Hb的氧饱和分数的氧饱和分数Y 的表达式为的表达式为血红蛋白与肌红蛋白血红蛋白与肌红蛋白氧合曲线的比较氧合曲线的比较血红蛋白的实际氧合曲线血红蛋白的实际氧合曲线推导氧合曲线推导氧合曲线实际氧合曲线实际氧合曲线图中的图中的n为为Hill系数系数血红蛋白推导氧合曲线血红蛋白推导氧合曲线误差的原因误差的原因 血红蛋白结合血红蛋白结合O2并不是并不是“全或无全或无”的，各个亚的，各个亚基结合基结合O2是依次进行的，并且前面亚基结合了是依次进行的，并且前面亚基结合了O2对对后面亚基与后面亚基与O2的结合有促进作用。实际测定的的结合有促进作

39、用。实际测定的n=2.8，若若n=1，则无协同作用，若，则无协同作用，若n 1则有正协同作用。对则有正协同作用。对于血红蛋白来说，当于血红蛋白来说，当 n=4 时正协同作用最大，即当时正协同作用最大，即当1个个O2与与1个亚基结合后，另外个亚基结合后，另外3个亚基也同时与个亚基也同时与O2结合。实际情况是结合。实际情况是n=2.8。这样，。这样，Hb对第对第4个个O2的亲的亲和力约为与第和力约为与第1个个O2亲和力的亲和力的300倍。倍。 血红蛋白运输氧的效率血红蛋白运输氧的效率 在肺泡中，氧分压为在肺泡中，氧分压为100 torr，工作肌肉的毛，工作肌肉的毛细血管中约为细血管中约为20 to

40、rr，血红蛋白在肺泡中，血红蛋白在肺泡中Y是是0.97，在肌肉毛细血管中在肌肉毛细血管中Y是是0.25，释放的，释放的O2是两个是两个Y值值之差，即之差，即Y=0.72。这个差值越大，运输这个差值越大，运输O2的效率的效率就越高。肌红蛋白不能担当此项工作。就越高。肌红蛋白不能担当此项工作。 血红蛋白别构的异种效应血红蛋白别构的异种效应 血红蛋白与血红蛋白与O2的结合受其它分子的调节，的结合受其它分子的调节，如如 H+、 C O2和和 2 , 3 - 二 磷 酸 甘 油 酸 （二 磷 酸 甘 油 酸 （ 2 , 3 -bisphosphate glycerate，BPG）等。虽然它们）等。虽然它

41、们在蛋白质分子上的结合部位离血红素很远，但在蛋白质分子上的结合部位离血红素很远，但这些分子极大地影响这些分子极大地影响Hb的氧合性质，这是别构的氧合性质，这是别构效应中的异种效应。效应中的异种效应。 2,3-二磷酸甘油酸2,3-bisphosphate glycerate，BPGBohr效应效应 组织中代谢作用产生组织中代谢作用产生H+和和CO2，代谢越旺，代谢越旺盛的组织，需要的盛的组织，需要的O2越多，产生的越多，产生的H+和和CO2也也越多。越多。CO2在体内被水合成碳酸。在体内被水合成碳酸。 CO2水合的结果，使组织中水合的结果，使组织中pH下降，即下降，即H+上升。上升。 O2与血红

42、蛋白的结合受与血红蛋白的结合受pH和和CO2浓浓度的影响。去氧血红蛋白对度的影响。去氧血红蛋白对H+的亲和力比氧合的亲和力比氧合血红蛋白大。因此，增加血红蛋白大。因此，增加H+浓度将促进浓度将促进O2的释的释放。放。 HbO2 H+ HbH+O2Bohr效应 氧合血红蛋白在组织中释放的氧合血红蛋白在组织中释放的O2量除了受到量除了受到组织中低组织中低O2浓度的作用外，还受组织中低浓度的作用外，还受组织中低pH的的影响。后者叫做影响。后者叫做Bohr效应，因效应，因1904年发现此现象年发现此现象的丹麦生理学家的丹麦生理学家C. Bohr而得名。而得名。 产生产生Bohr效应的原因是血红蛋白中一

43、些效应的原因是血红蛋白中一些pK值处于值处于7附近的可解离基团的作用，主要是附近的可解离基团的作用，主要是His，它们解离与否会影响到血红蛋白的构象，从而影它们解离与否会影响到血红蛋白的构象，从而影响血红蛋白对响血红蛋白对O2的亲和力。的亲和力。Mb和在不同pH下Hb的氧合曲线CO2与Hb的结合 血红蛋白还能结合血红蛋白还能结合CO2 ，结合部位是亚基，结合部位是亚基N末端游离的末端游离的NH2。CO2的结合也能促进的结合也能促进O2的释放。的释放。 BPG与Hb的结合 2,3-二磷酸甘油酸（二磷酸甘油酸（BPG）是血红蛋白一个重）是血红蛋白一个重要的别构效应剂（别构抑制剂）。正常人红细胞中要

44、的别构效应剂（别构抑制剂）。正常人红细胞中约含有约含有4.5mmol/L的的BPG，约与血红蛋白等摩尔数。，约与血红蛋白等摩尔数。每个每个Hb分子（四聚体）只有一个分子（四聚体）只有一个BPG结合位点，结合位点，位于由位于由4个亚基缔合形成的中央孔穴内。高负电荷个亚基缔合形成的中央孔穴内。高负电荷的的BPG分子与每个分子与每个链的若干个残基的带正电荷基链的若干个残基的带正电荷基团通过静电结合于团通过静电结合于Hb分子上，分子上，BPG把两个把两个链交联链交联在一起。在一起。O2的结合使中央孔穴变小，使的结合使中央孔穴变小，使BPG结合变结合变得困难。在没有得困难。在没有BPG存在时，存在时，O

45、2的结合容易，而在的结合容易，而在有有BPG存在时，存在时，O2的结合变得困难。的结合变得困难。 BPG分子结构及其与Hb两个链的离子结合BPG对Hb氧合曲线的影响 BPG对对R态态Hb的亲和力至少比对的亲和力至少比对T态态Hb低一个低一个数量级，数量级，BPG对对R态态Hb的亲和力大小顺序为：的亲和力大小顺序为：HbO2 Hb(O2)2 Hb(O2)3 ，而对，而对Hb(O2)4则完全不结合。则完全不结合。 BPG浓度越大，浓度越大，Hb的氧合曲线就越往右偏移，的氧合曲线就越往右偏移，说明说明BPG抑制抑制O2的结合，并增加了正协同效应。的结合，并增加了正协同效应。BPG的存在可以增加的存在

46、可以增加Hb在组织中的卸氧量。正常情在组织中的卸氧量。正常情况下供给组织的氧量约为血液所能携带的最大氧量况下供给组织的氧量约为血液所能携带的最大氧量的的40%（即（即Y = 40%）。）。BPG对Hb氧合曲线的影响BPG的生理作用 人的某些生理性或病理性缺氧可以通过红细胞人的某些生理性或病理性缺氧可以通过红细胞中中BPG浓度的升高而代偿。当正常人在短时间内由浓度的升高而代偿。当正常人在短时间内由海平面上升到海平面上升到4500m高的高山上时，红细胞中的高的高山上时，红细胞中的BPG浓度几个小时后就开始上升，两天内可由浓度几个小时后就开始上升，两天内可由4.5mmol/L增加到增加到7.5mmo

47、l/L，使氧的释放量增大。，使氧的释放量增大。值得注意的是，值得注意的是，BPG浓度增加对肺中浓度增加对肺中Hb与与O2的结的结合影响不大。合影响不大。三、血红蛋白分子病镰刀状细胞贫血病 镰刀状细胞贫血病（镰刀状细胞贫血病（sickle-cell anemia）是最早）是最早被认识的一种分子病。这种病在非洲某些地区十分被认识的一种分子病。这种病在非洲某些地区十分流行（高达流行（高达40%），它是由于遗传基因的突变导致），它是由于遗传基因的突变导致血红蛋白分子中氨基酸残基被改变造成的。镰刀状血红蛋白分子中氨基酸残基被改变造成的。镰刀状细胞贫血病人血红蛋白含量仅为正常人（细胞贫血病人血红蛋白含量仅

48、为正常人（1516g/100ml）的一半，红细胞数目也是正常人（）的一半，红细胞数目也是正常人（4.66.2106个个/ml）的一半左右，而且红细胞的形态也）的一半左右，而且红细胞的形态也不正常，除了有非常大量的未成熟红细胞外，还有不正常，除了有非常大量的未成熟红细胞外，还有很多成镰刀状的红细胞。当红细胞脱氧时，镰刀状很多成镰刀状的红细胞。当红细胞脱氧时，镰刀状红细胞的数量明显增加。这种病人的血红蛋白称为红细胞的数量明显增加。这种病人的血红蛋白称为HbS。 正常红细胞与镰刀状红细胞贫血病人的红细胞比较镰刀状细胞贫血病 镰刀状细胞贫血病是一种致死性疾病，它的纯镰刀状细胞贫血病是一种致死性疾病，它

49、的纯合子患者有的在童年就死亡。杂合子患者的寿命也合子患者有的在童年就死亡。杂合子患者的寿命也不长，但它能抵抗一种流行于非洲的疟疾。这种疟不长，但它能抵抗一种流行于非洲的疟疾。这种疟疾也是一种致死性疾病，甚至具有正常血红蛋白的疾也是一种致死性疾病，甚至具有正常血红蛋白的人死于这种疟疾的比例也很高，常常在还没有繁殖人死于这种疟疾的比例也很高，常常在还没有繁殖后代就已死去后代就已死去。Hbs杂杂合子患者对这种疟疾有一定合子患者对这种疟疾有一定的抵抗能力，尚能繁殖后代，这是因为杂合子患者的抵抗能力，尚能繁殖后代，这是因为杂合子患者加速被感染红细胞的破坏而中断疟原虫的生活周期加速被感染红细胞的破坏而中断

50、疟原虫的生活周期的缘故。的缘故。HbA和HbS的胰蛋白酶消化液的指纹图谱（先垂直方向滤纸层析，后水平方向电泳）（先垂直方向滤纸层析，后水平方向电泳）HbAHbSHbA和HbS氨基酸序列的比较HbA H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys C端端HbS H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val -Glu-Lys C端端 （链）链） 1 2 3 4 5 6 7 8（示差异处）（示差异处）HbS聚集成纤维状沉淀 6残基位于分子表面，当残基位于分子表面，当Val取代了取代了Glu后，在后，在分子的表面多了一个疏水基团。血红蛋白的氧合性分子的表面多了一个疏水

51、基团。血红蛋白的氧合性质和别构性质不受此变化的影响，但这一变化显著质和别构性质不受此变化的影响，但这一变化显著影响了血红蛋白的溶解度。在去氧血红蛋白分子表影响了血红蛋白的溶解度。在去氧血红蛋白分子表面的另一处有一个疏水性口袋，正好能与这个面的另一处有一个疏水性口袋，正好能与这个Val侧侧链结合，它们可以互相聚集成纤维状沉淀。氧合血链结合，它们可以互相聚集成纤维状沉淀。氧合血红蛋白表面没有这个疏水性口袋，所以只有在缺氧红蛋白表面没有这个疏水性口袋，所以只有在缺氧时，红细胞才会成为镰刀状。时，红细胞才会成为镰刀状。 HbS聚集成纤维状 两股两股HbS链连锁在一起链连锁在一起 1414股链纤维股链纤

52、维地中海贫血 地中海贫血可以由几条途径产生：地中海贫血可以由几条途径产生：缺失一个缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因；或多个编码血红蛋白链的基因；所有基因都存在，所有基因都存在，但一个或多个基因发生无义突变（但一个或多个基因发生无义突变（nonsense mutation），结果产生缩短了的肽链，或发生移码），结果产生缩短了的肽链，或发生移码突变，产生无功能的肽链。突变，产生无功能的肽链。所有基因都可能存在，所有基因都可能存在，但突变发生在编码区之外，导致不能转录，或转录但突变发生在编码区之外，导致不能转录，或转录后的加工不正确。后的加工不正确。 广东省是我国地中海贫血症发病率最高的地区，约有

53、广东省是我国地中海贫血症发病率最高的地区，约有11.07%11.07%的人的人（800800万人）携带地中海贫血症的基因（万人）携带地中海贫血症的基因（20052005年年5 5月月1111日中央电视台日中央电视台报道）。报道）。 四、免疫系统和免疫球蛋白（免疫球蛋白部分）（免疫球蛋白部分）免疫球蛋白，免疫球蛋白，Immunoglobulin, Ig免疫球蛋白G（Ig G）的结构免疫球蛋白G的空间填充模型鸡卵清溶菌酶与其抗体的结合抗体上的抗体上的抗原结合抗原结合结构域结构域鸡卵清溶菌鸡卵清溶菌酶（抗原）酶（抗原）鸡卵清溶菌鸡卵清溶菌酶上突出的酶上突出的Gln121鸡卵清溶菌酶与其抗体的结合抗体

54、上的抗体上的抗原结合抗原结合结构域结构域鸡卵清溶鸡卵清溶菌酶上突菌酶上突出的出的Gln121免疫沉淀的交联晶格免疫沉淀的交联晶格交联晶格交联晶格抗原决定簇抗原决定簇抗原抗原（含（含4 4个决定簇）个决定簇）抗体抗体人免疫球蛋白的各种类型 人的免疫球蛋白除了人的免疫球蛋白除了IgG外，还有外，还有IgA、IgM、IgD 和和 IgE，共有，共有5种类型，它们各自存在于人体的种类型，它们各自存在于人体的不同部位，起着不同的作用。不同部位，起着不同的作用。Ig 分子轻链恒定区分子轻链恒定区（CL）的氨基酸序列可分为两种基本类型：）的氨基酸序列可分为两种基本类型：和和，一个一个 Ig 分子只能含有其中

55、的一种。重链恒定区分子只能含有其中的一种。重链恒定区（包括（包括CH1、CH2和和CH3）的序列分为）的序列分为5种基本类种基本类型：型：（IgG）、）、（IgA）、）、（IgM）、）、（IgD）和和（IgE）。）。 各种各种Ig的结构IgD的结构与的结构与IgG类似类似IgGIgEIgAIgMIgM的结构二硫键二硫键酶联免疫吸附测定enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA血样中单纯疱疹病毒抗体的ELISA检测 An ELISA to test for the presence of herpes simplex virus (HSV) antibodi

56、es in blood samples. Wells were coated with an HSV antigen, to which antibodies against HSV will bind. The second antibody is antihuman IgG linked to horseradish peroxidase. Blood samples with greater amounts of HSV antibody turn brighter yellow.血清样品中单纯疱疹病毒抗体的ELISA检测酶标板或微孔板酶标板或微孔板尿激酶的免疫印迹测定(1,4),(2,

57、5),(3,6)-(1,4),(2,5),(3,6)-纯化程度逐步增高的尿激酶样品纯化程度逐步增高的尿激酶样品免疫印迹免疫印迹这种检测这种检测某种蛋白某种蛋白的方法称的方法称为为Western blotting尿激酶单尿激酶单抗检测抗检测 单克隆抗体的制备方法用目的抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏制成用目的抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏制成B淋巴淋巴细胞细胞悬液；悬液；繁殖小鼠骨髓瘤细胞；繁殖小鼠骨髓瘤细胞；将制得的将制得的B淋巴淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞；瘤细胞；转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基中进行转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基中进行选择性培养；选择

58、性培养； 用用ELISA法筛选出能分泌目的抗体的单克隆杂交法筛选出能分泌目的抗体的单克隆杂交瘤细胞株；瘤细胞株；扩大培养，从培养液中提取纯化单克隆抗体。扩大培养，从培养液中提取纯化单克隆抗体。五、肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩 ( (肌纤维的结构肌纤维的结构) ) 脊椎动物的骨骼肌又称横纹肌或随意肌。肌肉脊椎动物的骨骼肌又称横纹肌或随意肌。肌肉由许多平行的肌纤维束或称肌束组成。肌束中的每由许多平行的肌纤维束或称肌束组成。肌束中的每个肌纤维就是一个骨骼肌细胞，它是长柱形的多核个肌纤维就是一个骨骼肌细胞，它是长柱形的多核细胞，直径约细胞，直径约在在20100m之间，长可达之间，长可达5cm以上，

59、以上，人体的一些肌纤维甚至可达人体的一些肌纤维甚至可达50cm。肌细胞间有少量肌细胞间有少量结缔组织，并有毛细血管和神经纤维等。结缔组织，并有毛细血管和神经纤维等。 骨骼肌的组织水平肌纤维的细胞水平 肌纤维（肌细胞）是由多个称为成肌细胞的肌肌纤维（肌细胞）是由多个称为成肌细胞的肌肉前体细胞融合而成的。每个肌纤维肉前体细胞融合而成的。每个肌纤维含有约含有约1000个个肌原纤维，肌原纤维直径肌原纤维，肌原纤维直径2m。这些肌原纤维处于。这些肌原纤维处于肌浆中。核一般处在细胞的周边，质膜的内表面。肌浆中。核一般处在细胞的周边，质膜的内表面。肌纤维中含有许多线粒体，在肌肉收缩时提供能源肌纤维中含有许多

60、线粒体，在肌肉收缩时提供能源物质物质ATP，肌纤维中的内质网称为肌质网，分布在，肌纤维中的内质网称为肌质网，分布在各肌原纤维的周围，肌肉收缩时由它提供所需的各肌原纤维的周围，肌肉收缩时由它提供所需的Ca2+。 肌原纤维的结构 肌原纤维呈现一个很有规则的周期性结构，暗肌原纤维呈现一个很有规则的周期性结构，暗带和明带交替排列。明带折射率是各向同性的，因带和明带交替排列。明带折射率是各向同性的，因此又称各向同性此又称各向同性带（带（isotropic band），简称），简称 I 带；带；暗 带 是 各 向 异 性 的 ， 所 以 又 称 各 向 异 性 带暗 带 是 各 向 异 性 的 ， 所 以