冰冻切片切片RNA FISH方法及详细步骤

1、冰冻切片切片RNAFISH方法及详细步骤1.检测理RNA荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization)，简称为RNAFISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。传统的RNAFISH，直接在oligos上标记荧光素，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号，该方法一般需要20个oligos以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。本系统中SA（链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66KDa，每一分子SA能够与四分子生物素进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。应用该原理，我们将染料Cy3偶联到SA蛋白上，一分子SA能偶联上

2、6个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA能与4条oligoBiotin结合，每个SA上有6个Cy3，也就是每一条探针上连接了6个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用。1. 具体步骤：1）复水冰冻切片取出，每张切片滴加BufferB100卩，室温放置15min（使组织细胞恢复活性）；2）吸弃BufferB，PBS洗切片两次，每次5min（建议在染缸中进行）。2. 蛋白酶K消化1）蛋白酶K工作液预热至37°C；2）每张切片滴加蛋白酶K工作液100卩1，37°C孵育20min（消化时间请根据不同样本进行调整）；3）吸弃蛋白酶K，每张切片滴加

3、100卩1lx封闭液，37度30min；4）吸弃1X封闭液，每张切片滴加100m2xBufferC在室温下漂洗切片3-3oeHi£°（H91-31MSSWgT3o££尋阜w習船觀刃马网至EOOl曲耿巨蛊匹程主导）49121MS3o££7出祁匹程囚削壬畐（9【出卑型出卑田出逆黑丁黑'翌吕国目旳図马网歪E001曲耿出酸羽莺出酸畐讯丞W'尊睡男软（$【E国3冋尹日E06业翌助工目旳E01驳丁坯（V【皤l：8T：1zT：L1：1皿同i鋼祁日£3-VS吐怜旳舌翰轨章诬涮jb）uiui0£L£%HdE

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