ABTS自由基清除能力测定法ABTS测定法操作图解-ABTS清除法(最新版)- 以高香草酸为例

1、ABTS自由基清除能力测定法-ABTS测定法-操作图解-ABTS清除法（最新版）-以高香草酸为例【原理】ABTS法常常被用于检测物质的体外抗氧化能力。稳定的自由基ABTS+溶液显蓝绿色，在734nm上有最大吸收。这种自由基可以通过ABTS与K2S2O8反应生成。当自由基被清除，数量减少，它的溶液颜色会变浅，734nm下吸光度降低，由此可以来判断样品清除ABTS+的能力。图1.ABTS结构式【实验对象】高香草酸（Homovanillicacid），学名“4-羟基-3-甲氧基苯乙酸”分子式为C9H9O4，为儿茶酚胺（肾上腺素、去甲肾上腺素）的代谢产物。关于高香草酸抗氧化活性的研究非常少，因其结构与

2、咖啡酸相比少一个双键，高香草酸与咖啡酸的抗氧化活性作用有相似之处，故提出研究。本实验仅用于验证ABTS实验可行性与合理性。图3.高香草酸结构式图4.高香草酸的分子模型（基于Chem3D,MM2优化）【仪器与试剂】1仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100"、100-1000"、1000-5000"）；微量比色皿。2试剂Homovanillicacid（AR）、ABTS（AR）、无水乙醇（AR）；KSO（AR）228【实验操作】清除ABTS能力检测本实验采用文献1的方法，并视情况改动。我们

3、选取Caffeicacid作1.ABTS自由基储备液的配置0.2mL7.4mmol/LABTS储备液+0.2mL2.6mmol/LK2S2O8储备液为实验对象，其实验过程大致如下：避光放置12h使用前用95%乙醇稀释成ABTS+工作液，要求在300，734nm波长下的吸光度为0.700±0.02。2.样品液的配置预试样品先配置成1mg/mL>根据预试结果调节浓度溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。3.预试800"ABTS自由基溶液+少量样品液先少后多渐加>溶液颜色基本褪去时，记下加样量在此加样量的基础上，往前设置5个用量，使之

4、成等差数列。4.测定A0值：800|1LABTS溶液+200"95%乙醇混合>测在734nm处A734nm值，为A。5.测定A值：800"ABTS溶液+高香草酸溶液（0.0005mol/L）x"（x为2，4，6，8,10，12，14，16）+95%乙醇（200-x）"混合，静置6min>加样情况如表1所示。实验设试剂空白组和样品实验组，平行测定3次取平均值。表1清除ABTS+能力测定的加样表测A734nm，实验平行检测三次样品液（卩L）95%乙醇（吐）ABTS+工作液（卩L）总体积（卩L）219880010004196800100061948

5、00100081928001000101908001000121888001000141868001000161848001000计算公式：清除率=（A0-A）/A0*100%式中，A0为样品浓度为0时的A734nm值；A为样品的A734nm值。【注意事项】每次使用前先测量空板吸光度并保存数据，实际吸光度=测量吸光度-空板吸光度。当加入较少量样品(如2卩1)时，移液器尽量垂直打入孔内，如挂液在枪头可轻轻触碰孔内液体使其吸附，但注意下次取样需换枪头；如样品沾到孔壁，可把移液器调制10"左右，吸取孔内溶液以冲壁，同样下次取样需换枪头。以上操作枪头均不能触碰孔板底以免损坏枪头。【实验结果】

6、表2.ABTS清除法实验数据ABTS清除法Homovanillicacid(0.O005mol/L)A0:0.601IC50:0.O02889mmol/L加样量(yL)最终浓度(mmol/L)吸光度A清除率平均清除率SD20.0010.47123.90953219.978463.4510440.50418.5783520.51117.44749640.0020.35445.3703741.100823.8311820.38939.9691360.40237.96296360.0030.28457.09969857.653582.3900190.26360.2719030.29455.58912

7、480.0040.22467.10719564.39063.8418430.26161.674009100.0050.1572.27356772.704870.7470340.1572.2735670.14373.567468120.0060.08285.11796784.331522.3686350.10181.6696910.07686.206897140.0070.0590.89253291.621129330.6567490.04392.1675770.04591.803279160.0080.03893.14079493.922984360.6833820.03294.2238270.03194.40433210080o60200i1I'I1I1I1I1I1I1I1I0.0000.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.009Concentration(mmol/L)图5.Homovanillica量效曲线(实验结果以平均值士标准差表示，n=3)【参考文献】1XicanLi,TingtingWang,JingjingLiu,YulongLiu,JunZhang,JianLin,ZhongxiangZhao,DongfengChen.Effecta