医学免疫学实验：理论讲授

1、LOGO免疫实验理论讲授免疫实验理论讲授主要内容主要内容v示范教学示范教学 血清学反应血清学反应 单克隆抗体技术单克隆抗体技术v本学期实验本学期实验 多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备 T T淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 NKNK细胞毒活性的检测细胞毒活性的检测血清学反应血清学反应血清学反应血清学反应抗原抗原(antigen)(antigen)是一类能刺激机体免疫系统产生抗体和是一类能刺激机体免疫系统产生抗体和/ /或或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内外发生特异性结合而出现反应的物质。外发生特异性结合而出现反应的物质。抗体（抗体

2、（antibodyantibody）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。血清中，也分布于组织液及外分泌液中。血清学反应：血清学反应：是体外发生的抗原抗体反应，根据可见的是体外发生的抗原抗体反应，根据可见的现象判定反应结果。现象判定反应结果。 微生物鉴定微生物鉴定 传染病及寄生虫病诊断检测传染病及寄生虫病诊断检测二、血清学试验的特点二、血

3、清学试验的特点（一）特异性和交叉性（一）特异性和交叉性 （二）敏感性（二）敏感性 （三）可逆性（三）可逆性 （四）反应的二阶段性（四）反应的二阶段性 （五）最适比例与带现象（五）最适比例与带现象 （六）用已知测未知（六）用已知测未知 血清学反应血清学反应三、影响血清学试验的因素三、影响血清学试验的因素（一）电解质（一）电解质 （二）温度（二）温度 （三）酸碱度（三）酸碱度 （四）振荡（四）振荡 （五）杂质和异物（五）杂质和异物 血清学反应血清学反应血清学反应血清学反应三、血清学反应类型三、血清学反应类型（一）（一）凝集反应凝集反应 （二）沉淀反应（二）沉淀反应 （三）补体结合反应（三）补体结合

4、反应 （四）中和反应（四）中和反应 （五）免疫酶标技术（五）免疫酶标技术 血清学反应血清学反应凝集反应凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（Agglutination testAgglutination test）。参与凝集试验的抗原称凝集原，）。参与凝集试验的抗原

5、称凝集原，抗体称凝集素。参与凝集试验的抗体主要为抗体称凝集素。参与凝集试验的抗体主要为IgGIgG和和IgMIgM。凝集试验可用于检测抗体或抗原，凝集试验可用于检测抗体或抗原， 最突出的优点是操作最突出的优点是操作简便，便于基层的诊断工作。简便，便于基层的诊断工作。血清学反应血清学反应凝集反应的类型凝集反应的类型1 1、直接直接凝集反应凝集反应 颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称直接凝集试验。称直接凝集试验。（1 1）玻片法）玻片法 （沙门氏菌、链球菌、血型鉴定）（沙门氏菌、链球菌、血型鉴定）（2 2）试管法）试管法 （布氏杆菌病

6、诊断）（布氏杆菌病诊断）2 2、间接凝集反应间接凝集反应 将可溶性抗原将可溶性抗原( (或抗体或抗体) )先吸附于一种与免疫无关、一定大先吸附于一种与免疫无关、一定大小的不溶性颗粒的表面，然后与相应的抗体小的不溶性颗粒的表面，然后与相应的抗体( (或抗原或抗原) )作用，作用，在有电解质存在的适宜条件下，所发生的特异性凝集反在有电解质存在的适宜条件下，所发生的特异性凝集反应，称为间接凝集试验应，称为间接凝集试验 （1 1）正向间接凝集反应）正向间接凝集反应（2 2）反向间接凝集反应）反向间接凝集反应 （3 3）间接凝集抑制反应）间接凝集抑制反应 血清学反应血清学反应（1 1）玻片法）玻片法 定

7、性试验，在玻璃板或瓷片上进行。将含有已知抗体的诊断血清与待定性试验，在玻璃板或瓷片上进行。将含有已知抗体的诊断血清与待检悬液各一滴在玻板上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，检悬液各一滴在玻板上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。用已知抗体检测未知抗原。即为阳性反应。用已知抗体检测未知抗原。新分离的细菌的鉴定、血型鉴定等。新分离的细菌的鉴定、血型鉴定等。抗抗A A抗抗B B待测红细待测红细胞悬液胞悬液血清学反应血清学反应（2 2）试管法）试管法定量试验，在试管中进行，用以检测待检血清中是否存在相应抗体和检定量试验，在试管中进行，用以检测待检血清中是否存在相应抗体和检测该抗

8、体的效价（滴度），应用于临床诊断或流行病学调查。用已知抗测该抗体的效价（滴度），应用于临床诊断或流行病学调查。用已知抗原检测未知抗体。原检测未知抗体。 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 C待测血清倍比稀释待测血清倍比稀释已知抗原已知抗原血清学反应血清学反应沉淀反应沉淀反应可溶性抗原可溶性抗原( (如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等) )与相应的抗与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀

9、，称为沉淀试验（眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitation Precipitation reaction testreaction test）。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称）。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。沉淀素。 可溶性可溶性AgAg 相应相应AbAb 肉眼可见沉淀物肉眼可见沉淀物电解质电解质比例适当比例适当血清学反应血清学反应 沉沉 淀淀 反反 应应环状沉淀反应环状沉淀反应絮状反应絮状反应琼脂扩散琼脂扩散单扩散单扩散双扩散双扩散电泳电泳火箭电泳火箭电泳对流免疫电泳对流免疫电泳+血清学反应血清学反应沉淀反应的分类沉淀反应的分类单扩散沉淀单扩散沉淀即将定量的抗

10、体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔加入抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故该试验是定量试验沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故该试验是定量试验。应用应用: :广泛应用于兽医临床，如鸡马立克氏病诊断广泛应用于兽医临床，如鸡马立克氏病诊断。缺点需要经。缺点需要经1 12 2天结果天结果。血清学反应血清学反应血清学反应血清学反应双扩散沉淀双扩散沉淀即将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中，二者会向四周扩散，在二者比例合适处二者比例合适处形成白色沉淀线。应用应用: : 检测检测 AFP HBsAg, AFP HBsAg, 协助疾病诊断协助疾病

11、诊断. v 定义：定义：即带电颗粒在电场的作用下向着相反的电极移动，即带电颗粒在电场的作用下向着相反的电极移动，称为电泳。称为电泳。v 原理：原理：大部分抗原在碱性溶液（大部分抗原在碱性溶液（pH8.2）中带负电荷，）中带负电荷，在电场中向正极移动；而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂在电场中向正极移动；而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极移动。电泳时，由于电渗作用，向相反的负极移动。 血清学反应血清学反应对流免疫电泳的原理v 蛋白质抗原在碱性环境中，其羧基发生电离而带负电荷，蛋白质抗原在碱性环境中，其羧基发生电离而带负电荷，在电泳时从在电泳时从负极向正极移动负极向正极移动。

12、v 抗体分子在电场中抗体分子在电场中从正从正极向负极移动极向负极移动。血清学反应血清学反应火箭免疫电泳火箭免疫电泳v单向扩散单向扩散+ +电泳：电泳：将单将单向扩散与电泳技术相结向扩散与电泳技术相结合的一种方法。合的一种方法。v沉淀峰的高度与抗原的沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比。浓度成正比。 抗原定量检测抗原定量检测血清学反应血清学反应单克隆抗体技术单克隆抗体技术多克隆抗体多克隆抗体 由于抗原分子具有多种由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受簇可激活具有相应抗原受体的体的B B细胞产生免疫应答，细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同因而可产生多

13、种针对不同抗原决定簇的抗体，这些抗原决定簇的抗体，这些由不同由不同B B细胞克隆产生的抗细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。体称之为多克隆抗体。 传统的方法制备的抗传统的方法制备的抗体是用抗原免疫动物后所体是用抗原免疫动物后所得。得。 单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体：单克隆抗体：抗原分子上的许多决定簇分别激活各个抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的具有不同基因的B B细胞。被激活的细胞。被激活的B B细胞分裂增殖形细胞分裂增殖形成效应成效应B B细胞（浆细胞）和记忆细胞（浆细胞）和记忆B B细胞，大量的浆细细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗

14、体分子分布到血液、体液胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。抗体，称为单克隆抗体。v 单一的单一的B B细胞克隆具细胞克隆具有相同的性状有相同的性状v B B细胞能分泌特异性细胞能分泌特异性抗体，不能长期培养抗体，不能长期培养v 骨髓瘤细胞不能分泌骨髓瘤细胞不能分泌抗体，能长期培养抗体，能长期

15、培养v 二者的融合细胞形成二者的融合细胞形成杂交瘤细胞，既能分杂交瘤细胞，既能分泌特异性抗体，又能泌特异性抗体，又能连续传代培养连续传代培养单克隆抗体技术单克隆抗体技术杂交瘤技术杂交瘤技术杂交瘤技术原理：杂交瘤技术原理：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HATHAT培养基的选择培养：培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤增殖的杂交瘤细胞系细胞系单克隆抗体生成：单克隆抗体生成：接种杂交瘤接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高

16、效价的单克隆抗体中即可得到高效价的单克隆抗体单克隆抗体技术单克隆抗体技术杂交瘤细胞培养的关键杂交瘤细胞培养的关键HATHAT培养基：培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要合成主要途径途径T(Thymidine)：胸胸腺嘧啶核苷；腺嘧啶核苷；“核苷酸前体核苷酸前体”，供细胞通过替，供细胞通过替代途径合成代途径合成DNADNAHATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的主要途径被合成的主要途径被A A阻断阻断

17、骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT（次黄嘌呤次黄嘌呤- -鸟嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶磷酸核糖转移酶 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferasehypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase ）缺乏，缺乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术杂交瘤细胞筛选：杂交瘤细胞筛选：杂交瘤细胞在融合后杂交瘤细胞在融合后2 2周左右即可筛选，即把分泌所需周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂

18、交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、检测。选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。可靠、花费小和节省人力。常用的抗体检测方法：常用的抗体检测方法：（1 1）免疫酶技）免疫酶技（2 2）免疫荧光技术）免疫荧光技术（3 3）间接血凝试验）间接血凝试验（4 4）放射免疫测定）放射免疫测定阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存有限稀释法有限稀释法(limitingdilution)显微操作法显微操作法(micromanipulation)FACS法（法

19、（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法软琼脂平板法(softagarmethod)单克隆抗体技术单克隆抗体技术主要内容主要内容v示范教学示范教学 血清学反应血清学反应 单克隆抗体技术单克隆抗体技术v本学期实验本学期实验 多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备 T T淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 NKNK细胞毒活性的检测细胞毒活性的检测 由于抗原分子具有多由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原定簇可激活具有相应抗原受体的受体的B B细胞产生免疫应答，细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同因而可产生多种针对不同抗

20、原决定簇的抗体，这些抗原决定簇的抗体，这些由不同由不同B B细胞克隆产生的抗细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。体称之为多克隆抗体。 传统的方法制备的抗传统的方法制备的抗体是用抗原免疫动物后所体是用抗原免疫动物后所得。得。 多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备免疫动物的选择免疫动物的选择供免疫用的动物主要有哺乳粪和禽类其中常用的有家供免疫用的动物主要有哺乳粪和禽类其中常用的有家兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时根据需要也可选用鼠，山羊兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时根据需要也可选用鼠，山羊和马等。选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗和马等。选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗

21、原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体的选择等因素。如甾体激素多用家兔；求以及动物个体的选择等因素。如甾体激素多用家兔；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。制备。 多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备佐剂（佐剂（adjuvant adjuvant ）一类非特异性免疫增强剂，先一类非特异性免疫增强剂，先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂种类佐剂种类

22、 a. a. 油性乳剂油性乳剂 弗氏佐剂（弗氏佐剂（Freund adjuvantFreund adjuvant）b b. . 无机化合物无机化合物c c. . 微生物及其产物微生物及其产物d d. . 脂质体脂质体e e. .免疫刺激复合物（免疫刺激复合物（ISCOMISCOM）f. f. 细胞因子细胞因子 用于人体的佐剂：用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、氢氧化铝、明矾、poly ICpoly IC、胞壁酰、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂弗氏佐剂(Freunds adjuvant) (Freunds adjuva

23、nt) 弗氏佐剂弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)(Freund,s adjuvant)：弗氏完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗 试剂: 抗原：OVA（卵清蛋白） 抗体： 一级抗体：小鼠血清 二级抗体：HRP-Ab 封闭液：5% 脱脂奶粉 包被缓冲液 抗体稀释液：PBS 洗液：PBST 底物溶液：OPD 终止液：2M 硫酸 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂器材器材: : 9696孔板孔板 加样器加样器( (一套）一套） 加样器头（一套）加样器头（一套） 吸水纸吸水纸（若干）（若干） 酶

24、标仪（一台）酶标仪（一台） 1.5mlEP1.5mlEP管：管：2020个个/ /组组 4mlEP4mlEP管：管：2 2个个/ /组组实验器材及物品实验器材及物品主要操作步骤主要操作步骤一、一、免疫小鼠免疫小鼠二、二、制备血清制备血清三、三、用用ElisaElisa法检测血清中抗体的效价法检测血清中抗体的效价v 免疫方式免疫方式 肌肉注射肌肉注射（intramuscular injection intramuscular injection ，i.m.i.m.） 腹腔注射腹腔注射（intraperitoneal injectionintraperitoneal injection，i.p.

25、i.p. ） 皮下注射（皮下注射（subcutaneous injectionsubcutaneous injection，s.c.s.c.） 静脉注射（intravenous injection ，i.v.）v 抗原：OVA 7天免疫一次，共三次v 免疫佐剂免疫佐剂 弗氏佐剂弗氏佐剂(Immunoadjuvant ) (Immunoadjuvant ) 不完全弗氏佐剂（石蜡油不完全弗氏佐剂（石蜡油+ +羊毛脂）羊毛脂） 免疫小鼠免疫小鼠v 摘取小鼠眼球，用1.5ml EP管接血。v 拉颈处死小鼠。 v 4000rpm，离心10分钟，吸取上清（血清）待用。制备血清制备血清v 酶联免疫吸附（酶联

26、免疫吸附（ enzyme-linked immunosorbent assay enzyme-linked immunosorbent assay ， Elisa Elisa ）v 利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应应v ELISAELISA是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来测量机体的是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来测量机体的可溶性的抗原或抗体。可溶性的抗原或抗体。v

27、 由于它敏感性高，可测微量的的抗体或激素、细胞因子及粘附分子等由于它敏感性高，可测微量的的抗体或激素、细胞因子及粘附分子等抗原性物质。抗原性物质。免疫小鼠血清抗体效价测定免疫小鼠血清抗体效价测定酶联免疫吸附的基本原理酶联免疫吸附的基本原理 利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体簇结合，形成固相抗体- -抗原抗原- -酶标抗体免疫复酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生

28、比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量成的有色物质量(OD(OD值值) )，即可确定待测抗原，即可确定待测抗原含量。含量。固相载体固相载体v 固相载体在固相载体在ELISAELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作与化学反应。可作ELISAELISA中载体的材料很多，最常用的中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。性。 酶结合物酶结合物 酶结合物是酶与抗体

29、或抗原联结的产物。具有酶促反应，酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在显示出生物放大作用。在ELISAELISA中，常用的酶为辣根过氧中，常用的酶为辣根过氧化物酶化物酶(horseradish peroxidase, HRP)(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶和碱性磷酸酶(alkaline (alkaline phosohatase, AP)phosohatase, AP)。酶的底物酶的底物1 1、HRPHRP催化过氧化物的氧化反应。催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺供氢体：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺

30、、四甲基联苯胺(TMB) (TMB) OPD OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为吸收波长为492nm492nm TMB TMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色，用作用后共产物显蓝色，用HCLHCL或或H H2 2SOSO4 4终止后，终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 405nm 2 2、APAP为磷酸酯酶为磷酸酯酶 一般采用对一般采用对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯(p-NPP)(p-NPP)作为底物。产物为黄色作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在的对硝基酚，在405nm405nm波长处有

31、吸收峰。用波长处有吸收峰。用NaOHNaOH终止酶终止酶反应反应包包 被被: : OVAOVA抗原抗原(50ug/ml) 100L/(50ug/ml) 100L/孔孔, 4 , 4 过夜过夜. .封封 闭：闭：弃上清弃上清, , 加入封闭液加入封闭液 150 L/150 L/孔孔, 37, 37，40min.40min.洗洗 涤涤: : 弃上清，加洗液弃上清，加洗液200ul/200ul/孔，洗涤三次孔，洗涤三次, , 每次每次3 3分钟分钟. .一一 抗抗: : 弃上清弃上清, , 加入不同稀释度的待测血清抗体加入不同稀释度的待测血清抗体100 L/100 L/孔孔37 37 ，40min.

32、 40min. 洗洗 涤涤: :弃上清，加洗液弃上清，加洗液200ul/200ul/孔，孔，3 3分钟分钟, ,弃上清，再重复两次弃上清，再重复两次酶标抗体酶标抗体: :弃上清弃上清, ,加入加入HRPHRP标二抗标二抗100 L/100 L/孔孔37 40min.37 40min.洗洗 涤涤: :弃上清，洗涤三次弃上清，洗涤三次, , 每次每次3 3分钟分钟显显 色色: :弃上清，加入底物弃上清，加入底物100 L/100 L/孔，避光孔，避光10min10min加终止液加终止液: : 加加2M2M硫酸硫酸 50 L/50 L/孔孔测测 量量: : 酶标仪测定酶标仪测定OD 490nmOD

33、490nm值值. .实验步骤实验步骤抗体的倍比稀释抗体的倍比稀释1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/128001/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/128005L5L抗体抗体( (血清血清) )500L抗体稀释液抗体稀释液(PBS)500L 500L 500L 500L 500L 500L500L 500L 500L 500L 500L 500L 1 2 3 4 5 6 7 995L 995L 抗体稀释液抗体稀释液（PBSPBS） 加佐剂组（加佐剂组（+ +）和不加佐剂组（）和不加佐剂组（）血清各做一套上

34、述稀释度血清各做一套上述稀释度每组一块每组一块9696孔板，每个样三个复孔，纵向排列。加样如下：孔板，每个样三个复孔，纵向排列。加样如下：1- 7: 1- 7: 不同稀释度的抗体，依次为不同稀释度的抗体，依次为1/2001/200，1/4001/400，1/8001/800，1/16001/1600，1/32001/3200，1/64001/6400，1/128001/12800； 8 8：阴性对照孔阴性对照孔。加板方法加板方法 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12ABCDEFGH 加加佐佐剂剂组组 不不加加佐佐剂剂组组v抗体效价抗体效价: :1. 1. 出现颜色变化的抗体最高稀

35、释倍数出现颜色变化的抗体最高稀释倍数 （目测）（目测）2. 2. 二倍于阴性对照二倍于阴性对照ODOD值值( (酶标仪）酶标仪）结果判定结果判定结果分析结果分析1 1观察实验现象：从加底物到终止反映是的颜色观察实验现象：从加底物到终止反映是的颜色 变化，及各个稀释度之间的颜色差异。变化，及各个稀释度之间的颜色差异。2 2判定出加佐剂组和不加佐剂组的抗体效价（二倍于阴性对照判定出加佐剂组和不加佐剂组的抗体效价（二倍于阴性对照ODOD值）。值）。3 3用用ExcelExcel处理数据，作图，横坐标为抗体的稀释度，纵坐标为处理数据，作图，横坐标为抗体的稀释度，纵坐标为ODOD490490的数值。的数

36、值。 4 4将用将用ExcelExcel图表和原始数据（每人一份）贴到实验记录本上。图表和原始数据（每人一份）贴到实验记录本上。ExcelExcel作图作图主要内容主要内容v示范教学示范教学 血清学反应血清学反应 单克隆抗体技术单克隆抗体技术v本学期实验本学期实验 多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备 T T淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 NKNK细胞毒活性的检测细胞毒活性的检测v 实验原理实验原理v 实验分组及材料实验分组及材料v 主要操作步骤主要操作步骤v 检测方法检测方法 实验主要内容实验主要内容v 淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、淋巴细胞在体外培养时，受到刺

37、激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。 v 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。免疫功能的指标之一。原理原理Lymphocytes(B/T)mitogensSpecificityAgProliferationtransformationlymphoblastNucleic AcidProtein

38、 v 有丝分裂原（有丝分裂原（mitogenmitogen）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细膜糖类及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂。胞活化和诱导细胞分裂。 v T T和和B B细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细胞向母细胞转化。这种转化细胞胞向母细胞转化。这种转化细胞DNADNA合成增加，出现细胞体积增大，合成增加，出现细胞体积增大，胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。胞浆

39、增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。 v 形态学观察法形态学观察法v3 3H-TdRH-TdR（3 3H-H-胸腺嘧啶核苷）掺入法胸腺嘧啶核苷）掺入法v MTTMTT法法 ( (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法） 本次实验采用本次实验采用 MTTMTT法法 常用的检测方法常用的检测方法v MTTMTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTTMTT是一种噻唑盐，是一种噻唑盐，化学名化学名3- 3-（4 4，5- 5-二甲基二甲基-2-2-噻唑）噻唑）-2 -2，5- 5-二苯基溴化四唑，水溶液二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。

40、小鼠脾细胞受到为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConAConA作用后发生增殖活化，其胞内线作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTTMTT作为其底物参与反应，形作为其底物参与反应，形成蓝色的甲簪（成蓝色的甲簪（FormazanFormazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用二）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用二甲亚砜甲亚砜(DMSO)(DMSO)溶解所生成的甲簪颗粒，其生成量与细胞数目和溶解所生成的甲簪颗粒，其生成量与细胞数目和/ /或细胞活性呈正相关，通过检测或细胞活性呈正相关，通过检测490nm490nm处光密度值变化，可间接处光密度值变化，可间接

41、反映细胞生长及增殖活性。反映细胞生长及增殖活性。 MTT MTT 法法MTT MTT 法法DMSO淋巴细胞转化率淋巴细胞转化率=对照孔值对照孔值ConA刺激孔值刺激孔值-对照孔孔值对照孔孔值100%v器材1. 1.75%75%酒精酒精若干若干2. 2.无菌纱网无菌纱网 1 1块块/ /组组3. 3.无菌平皿无菌平皿1 1块块/ /组组4. 4.无菌无菌9696孔培养板孔培养板1 1块块/ /组组5. 5.细胞计数板细胞计数板1 1套套/ /组组6. 6.显微镜显微镜1 1台台/ /组组7. 7.可调微量加样器可调微量加样器1 1套套/4/4人人8. 8.无菌吸头（大、中、小）无菌吸头（大、中、

42、小）1 1套套/4/4人人9. 9.EPEP管管25/425/4人人10.10. 眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子1 1饭盒饭盒/4/4人人11.11. 细胞培养箱（细胞培养箱（37 5%CO2)37 5%CO2)12.12. 酶标仪酶标仪 1 1台台13.13. 离心机离心机2 2个个/room/room14.14. 超净台超净台2 2个个/room/room15.15. 4mlEP4mlEP管：管： 1 1个个/ /组组 动物及试剂1. 1.小鼠小鼠 1 1只只/ /组组2. 2.培养液（培养液（1640) 1640) 无无FCS FCS 5ml/ 5ml/ 组组3. 3.培养液（培养液（16

43、40)10%FCS 1640)10%FCS 10ml/ 10ml/ 组组4. 4.1 1个空离心筒个空离心筒5. 5.ConAConA（200ug/ml) 200ug/ml) 1ml/room 1ml/room4. 4.MTTMTT（5mg/ml) 5mg/ml) 0.7ml/0.7ml/组组 5. 5.滤纸滤纸 一块一块6. 6.二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO)DMSO) 3ml/ 3ml/组组实验步骤实验步骤操作流程操作流程v单细胞悬液的制备单细胞悬液的制备1. 1.小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。2. 2.于超净台内取出脾组织，放入预先盛有于超净

44、台内取出脾组织，放入预先盛有2ml2ml无血清无血清16401640培养液的平皿内。培养液的平皿内。3. 3.用纱网包裹住脾组织，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其用纱网包裹住脾组织，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用捣碎。然后用1000ul1000ul加样器将脾细胞悬液吸出，放入加样器将脾细胞悬液吸出，放入50ml50ml离心管，用离心管，用2ml 2ml 16401640培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml50ml离心管中。离心管中。4. 4.2000rpm2000rpm，常温离心，常温离心6 6分钟，弃上清，

45、加分钟，弃上清，加3ml3ml含血清含血清16401640培养液重悬细胞。培养液重悬细胞。v细胞计数细胞计数1. 1.取上述制备好的细胞悬液混匀后取出取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul20ul，加到盛有，加到盛有980ul 1640980ul 1640培养基的培养基的EPEP管中，混匀后取出管中，混匀后取出20ul20ul到一个新的到一个新的EPEP管中，再向其中加入管中，再向其中加入20ul20ul台盼蓝染料，台盼蓝染料，混匀后取混匀后取20ul20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。2. 2.用含血清用含血清1640

46、1640培养液调细胞浓度至培养液调细胞浓度至1 110107 7/ml/ml，每组所需总量为，每组所需总量为3ml3ml。3. 3.注意注意: :在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准详细实验步骤详细实验步骤v 查出四个查出四个1616个大方格的总细胞数个大方格的总细胞数(X)(X)；v 算出每个大方格的细胞数：算出每个大方格的细胞数：A=X/4A=X/4v 每个大方格的体积为：每个大方格的体积为：V=1mmV=1mm1mm1mm0.1mm=0.1mm0.1mm=0.1mm3 3=10=10-4 -4mlmlv

47、制备的细胞悬液的细胞浓度（制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=A /ml)=A 10104 4稀释倍数稀释倍数(100)(100)细胞计数细胞计数v细胞培养细胞培养1. 1. 按图所示加板。按图所示加板。2. 2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%CO37 5%CO2 2培养箱中，培养培养箱中，培养4848小时。小时。vMTTMTT掺入：掺入：1. 1. 在终止培养前在终止培养前2 2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。小时，在显微镜下观察细胞转化情况。2. 2. 每孔内加入每孔内加入MTTMTT（5mg/ml) 20ul5m

48、g/ml) 20ul，加完后轻轻搕板，使，加完后轻轻搕板，使MTTMTT和细胞混匀。和细胞混匀。3. 3. 在在37 5%CO37 5%CO2 2培养箱中继续培养培养箱中继续培养2 2小时，取出板，观察颜色变化，然后离心小时，取出板，观察颜色变化，然后离心2000rpm2000rpm，10min10min，轻轻甩去上清，注意不要将孔底部的颗粒物弃出）观察板底是，轻轻甩去上清，注意不要将孔底部的颗粒物弃出）观察板底是否有蓝色的颗粒。否有蓝色的颗粒。4. 4. 加入加入100ul 100ul 二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO)DMSO)，轻轻晃板，将颗粒溶解。，轻轻晃板，将颗粒溶解。v结果测定：结果测

49、定：1. 1. 结果测量：用酶标仪测定结果测量：用酶标仪测定490nm490nm处光密度值（处光密度值（ODOD490490nmnm），记录结果。），记录结果。2. 2. 结果判定：结果判定：详细实验步骤详细实验步骤淋巴细胞转化率淋巴细胞转化率=对照孔值对照孔值ConA刺激孔值刺激孔值-对照孔孔值对照孔孔值100%100L ConA200ug/ml ConA ConA的倍比稀释的倍比稀释400L含含10%血血清的清的1640400L400L400L400L400L400L 1 2 3 4 5 6 7 900L含血清含血清的的1640201052.51.250.6250.313ug/ml 040

50、0L含含10%血血清的清的加加 板板 方方 法法 结结 果果 处处 理理v 算出算出SISI值，用值，用ExcelExcel作图，横坐标为作图，横坐标为ConAConA的浓度，纵坐标的浓度，纵坐标为为SISI值，要求带标准误差线。值，要求带标准误差线。v 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用ExcelExcel作的图作的图一起贴到实验记录本上。一起贴到实验记录本上。v 要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。 Excel Excel 作图作图淋巴细胞转化率淋巴细胞转化率主要内容主要内容v示范

51、教学示范教学 血清学反应血清学反应 单克隆抗体技术单克隆抗体技术v本学期实验本学期实验 多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备 T T淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 NKNK细胞毒活性的检测细胞毒活性的检测vNKNK（natural killer natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T T、B B细胞并列的第三类群淋巴细胞。细胞并列的第三类群淋巴细胞。vNKNK细胞从骨髓中衍生，发育成熟需要骨髓和胸腺细胞从骨髓中衍生，发育成熟需要骨髓和胸腺微环境微环境vNKNK细胞主要

52、分布于外周血中，占外周血单核细胞细胞主要分布于外周血中，占外周血单核细胞（PBMCPBMC）的）的5-10%5-10%，在淋巴器官中也有分布，分，在淋巴器官中也有分布，分布水平较外周血低布水平较外周血低。NKNK细胞功能：清除异常细胞细胞功能：清除异常细胞通过杀伤激活受体（KAR）直接识别通过抗体间接识别：ADCC分泌杀伤介质：perforin granzyme TNF IFN 通过杀伤激活受体（通过杀伤激活受体（KARKAR）直接识别）直接识别通过抗体间接识别：通过抗体间接识别：ADCCADCC实验原理实验原理 NKNK细胞细胞+ +靶细胞靶细胞靶细胞破裂靶细胞破裂, ,释放内容物释放内容物

53、胞浆内酶类胞浆内酶类 LDHLDH酶活性酶活性胞浆内蛋白胞浆内蛋白放射性铬酸钠放射性铬酸钠5151CrCr标记标记DNADNA3 3H-TdRH-TdR掺入掺入乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，细胞膜。当细胞受到损伤时，LDHLDH可从细胞内释放至培可从细胞内释放至培养液中。释放出来的养液中。释放出来的LDHLDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶中，使氧化型辅酶I(NADI(NAD+ +) )变成还原型辅酶变成还原型辅酶(NADH)(NADH)，后，后者再通过

54、递氢体者再通过递氢体- -吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)(PMS)还原还原碘硝基氯化碘硝基氯化氮唑蓝氮唑蓝(INT)(INT)或或硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝(NBT)(NBT)形成有色的甲基形成有色的甲基化合物，在化合物，在570nm570nm波长处有一吸收峰，利用读取的值，波长处有一吸收峰，利用读取的值，可测得杀伤细胞毒活性。可测得杀伤细胞毒活性。 乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法- -原理原理(INT)(INT)或或 (NBT)(NBT) 乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法最大释放均值（最大释放均值（Max）=最大释放孔最大释放孔cpm均值均值-最大释放对照孔最大释放对照孔

55、cpm均值均值自发释放均值（自发释放均值（S自发自发）=自发释放孔自发释放孔cpm均值均值-培养基对照孔培养基对照孔cpm均值均值 杀伤率杀伤率( %)=Max- S自发自发实验值实验值-自发释放值自发释放值 v器材器材1.75%酒精酒精 若干若干2.无菌纱网无菌纱网 1块块/组组3.无菌平皿无菌平皿 1块块/组组4.无菌吸头（大、中、小）无菌吸头（大、中、小）3盒盒/room5.无菌无菌96孔培养板孔培养板 1块块/组组6.可调微量加样器可调微量加样器 1套套/组组7.细胞计数板细胞计数板 1套套/组组8.显微镜显微镜 1台台/组组9.EP管管 若干若干10. 眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子

56、1套套/ 组组11. 细胞培养箱细胞培养箱 1台台/room12. 酶标仪酶标仪 1台台13. 离心机离心机 2个个/room14. 超净台超净台 1台台/组组15. 4mlEP管：管： 2个个/组组v动物、细胞及试剂1.小鼠小鼠 1只只/组组(NS,OVA)2.YAC-1 1*105 * 2ml 3.培养液（培养液（1640) 无无FCS 5ml/ 组组3.培养液培养液(1640) 3%FCS 10ml/组组3.LDH底物底物 3ml/组组4.柠檬酸（终止液）柠檬酸（终止液）1ml/组组实验分组及材料实验分组及材料操作流程操作流程v单细胞悬液的制备单细胞悬液的制备1. 1.小鼠脱臼处死，用酒精棉球