Takara实验技能讲座之Westernblot

1、蛋白相关产品介绍蛋白相关产品介绍-Western Blot上海皓嘉科技发展有限公司上海皓嘉科技发展有限公司什么是什么是Western blotWestern blot？2 免疫印迹（免疫印迹（immuno blotting）又称蛋白质印迹（）又称蛋白质印迹（western blot），它是根据抗），它是根据抗原抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白质的方法。原抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白质的方法。western blot是是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有于免

2、疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。现已成为蛋白分析的一种常规技术。用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白的丰度进行定性和半定量分析。用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白的丰度进行定性和半定量分析。HRP标记的二抗HRP底物(Luminol)化学发光信号Western blotWestern blot步骤步骤3 样品制备样品制备4 细胞裂解蛋白纯化蛋白定量细胞裂解细胞裂解5 xTractor Buffer635656xTractor Buffer Kit 635623 裂解细胞种类：Ba

3、cterial cells、Mammalian cellsYeast cells、Baculovirus-infected cellsYeast Protein Extraction Reagent9780酵母总蛋白质提取试剂酵母总蛋白质提取试剂简捷、快速的提取酵母菌总蛋白质的试剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂ProteoGuard EDTA-Free Protease Inhibitor Cocktail 635672Calpastatin7316细胞裂解液细胞裂解液CalpainCalpain竞争性抑制剂竞争性抑制剂细胞裂解：比较常用超声波破碎法和酶溶破碎法。6 蛋白纯化蛋白纯化高特异性的高特异

4、性的CoCo2+2+树脂：树脂：TALONTALON系列系列高产量的高产量的NiNi2+2+树脂：树脂：His60 NiHis60 Ni系列系列6 组氨酸标签融合蛋白质的纯化蛋白定量蛋白定量方法方法灵敏灵敏度度时间时间原理原理干扰物质干扰物质说明说明产品产品紫外吸收法20-100 mg/ml快速5-10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280 nm处的光吸收各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸干扰物质较多Bradford法1-1000 g/ml快速5分钟考马斯染料与蛋白质结合后，溶液的颜色发生变化。这种颜色的变化与溶液中的蛋白质浓度成正比。表面活性剂：TritonX-100；SDS操作简便；可对含有还原

5、剂的样品进行测定；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化。TaKaRa Bradford Protein Assay Kit（T9310A）BCA法0.02-2 mg/ml较快速30分钟内二价铜离子 (Cu+2) 在碱性条件下被蛋白质的肽键还原成一价铜离子 (Cu+) ，两个分子的BCA 络合一个一价铜离子 (Cu+) ，形成一种在562 nm处有强吸收值的紫色复合物。螯合剂、还原剂：EDTA、EGTA、-巯基乙醇不受蛋白质种类的影响；对表面活性剂的干扰影响小。TaKaRa BCA Protein Assay Kit（T9300A）7 8 相关产品相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA

6、法TaKaRa BCA Protein Assay KitT9300A500 次700不受蛋白质种类的影响，在0.022 mg/ml浓度范围内蛋白质浓度与吸光度值成线性关系；对表面活性剂的干扰影响小；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）Bradford法TaKaRa Bradford Protein Assay KitT9310A500 次500操作简便，可快速地对浓度范围在11,000g/ml的蛋白质溶液进行定量。可对含有还原剂的样品进行测定；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）8 9 Western blotWestern blot步骤步骤9 电泳电泳电泳(SDS-

7、PAGE)(SDS-PAGE)10 蛋白分子量蛋白分子量胶浓度胶浓度 40 kDa 80 kDa 12.5%小于40 kDa 15%大于80 kDa 10% 凝胶的选择样品制备还原处理的样品和非还原处理的样品同时电泳分子量Marker的选择预染蛋白marker普通蛋白marker设立对照样品设立比对样品空质粒对照样品、整个菌液、上清、沉淀对比样品与检测样品同时电泳SDS-PAGE电泳中蛋白质分子所带的电荷差异对电泳的影响是微乎其微的，可以忽略不计。SDS-PAGE电泳中白质的迁移速度与其分子量大小成反比，分子量越小，迁移速度越快。11 相关产品相关产品11 CLEARLY Stained Pr

8、otein Ladder3454ACLEARLY Protein Ladder (Unstained)3453ATris-Glycine-SDS Buffer (TG-SDS) Powder, pH8.3T9101Tris-Glycine Buffer (TG) Powder, pH8.3T9102TaKaRa CBB Protein Safe StainT9320Au 以CBB为主要成分制备的蛋白质高灵敏度染色液u 迅速（染色5分钟后可确认蛋白质片段）u 使用安全不含有害物质甲醇和乙酸可使用去离子水进行脱色2Protein SDS PAGE Loading Buffer91724Protei

9、n SDS PAGE Loading Buffer9173 上样上样loadingloading 预染预染MarkerMarker与非预染与非预染MarkerMarker 电泳缓冲液电泳缓冲液 染色液染色液12 电泳仪电泳仪12 垂直电泳系列产品垂直电泳系列产品详情请见：http:/ blotWestern blot步骤步骤13 转膜转膜转膜14 膜的选择常用的转移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白的结合能力高，灵敏度高，不易破碎，同时也适用于再次标记(Reprobing)（为了增加PVD膜的亲水性，膜使用前需浸泡在甲醇中）

10、。而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。膜标记好正反面膜标记好正反面转膜缓冲液Tris-Glycine Buffer (TG) Powder, pH8.3T9102转膜：蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上。15 转膜仪（转印仪）转膜仪（转印仪）15 水平半干转印系列产品水平半干转印系列产品详情请见：http:/ blotWestern blot步骤步骤16 封闭封闭封闭封闭剂的选择 有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果。另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及标记抗体的酶活性，应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂。17 注意避免让膜变干封闭的作用：为了防止蛋白检测用抗体非特异性

11、与膜结合，对未结合蛋白的膜区域进行封闭很重要。18 相关产品相关产品18 Western BLoT Blocking Buffer (Fish Gelatin)T7131AWestern BLoT Blocking Buffer (Protein Free）T7132A在TBS-T Buffer含有鱼源明胶的封闭缓冲液。同哺乳动物来源的奶粉和BSA相比，不会与哺乳动物来源抗体出现非特异性交叉反应。可抑制背景，能够明确地检测出抗原。不含蛋白质（Protein Free）的化学成分封闭缓冲液。同一般的脱脂奶粉相比，可提高检测灵敏度。有效地用于检测磷酸化蛋白质。19 洗涤洗涤洗涤液的选择一般使用PB

12、S或TBS缓冲液。根据目的蛋白和检测试剂选择洗涤液。选择不含抑制HRP的叠氮化钠的洗涤液比较好。磷酸化蛋白质适合使用TBS缓冲液或含Tween20的TBS缓冲液。19 Tris Buffered Saline with Tris Buffered Saline with Tween20 (TBS-T) Tablets, Tween20 (TBS-T) Tablets, pH7.6pH7.6T9142T9142 ELISA ELISA、Western BlottingWestern Blotting的清洗的清洗BufferBuffer或封闭或封闭BufferBuffer。 抗体稀释。抗体稀释。T

13、ris Buffered Saline (TBS) Tablets, Tris Buffered Saline (TBS) Tablets, pH7.6pH7.6T9141T9141 ELISA ELISA、Western BlottingWestern Blotting、免疫组织染色用的清洗、免疫组织染色用的清洗BufferBuffer。 样品稀释。样品稀释。Phosphate Buffered Saline with Phosphate Buffered Saline with Tween20 (PBS-T) Tablets, Tween20 (PBS-T) Tablets, pH7.4p

14、H7.4T9183T9183 ELISA ELISA、Western BlottingWestern Blotting的清洗的清洗BufferBuffer或封闭或封闭BufferBuffer。 抗体稀释。抗体稀释。Phosphate Buffered Saline (PBS) Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4Tablets, pH7.4T9181T9181 ELISA ELISA、Western BlottingWestern Blotting、免疫组织染色用的清洗、免疫组织染色用的清洗BufferBuffer。 清洗细胞。清洗细胞。

15、 样品稀释。样品稀释。Western Blotting操作过程中需洗膜，洗膜可除去未反应的试剂，抑制背景。20 Western blotWestern blot步骤步骤20 一抗孵育二抗孵育一抗孵育一抗孵育一抗的选择抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别多个抗原决定簇的多克隆抗体。另外有的抗体识别一级结构，有的抗体识别立体结构，后者不能与变性或还原的蛋白质结合。制备抗体时，如果免疫原是变性蛋白，那么制备的抗体只能与变性蛋白结合，不能与天然蛋白质结合。用于Western Blotting的一抗一般都有销售。购买抗体时要考虑以上几点，选择抗体时，对同一个抗原的不同类型抗体在产品数据上进行详细调

16、查后再购买，尽量使用特异性高的单克隆抗体。反应方法减少失败的最好方法是将高度稀释的低浓度抗体溶液添加到托盘中，放入膜后，4缓慢摇动过夜孵育。如果抗体使用量有限制，建议使用杂交袋，使用杂交袋时要确保不能有气泡。21 使用一抗进行目的蛋白的检测。抗体查询抗体查询22 http:/www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php抗体种类细胞间连接、钙粘着蛋白抗体细胞外基质关联骨代谢关联血小板关联信号传导关联等疾病相关抗体（IBL）His标签抗体二抗孵育二抗孵育二抗的选择可从不同宿主获得的二抗，如果背景较高，使用另一种宿主的二抗可减少背景

17、。还销售宿主以外的对动物种属来源血清蛋白进行吸收操作的抗体。确认动物种属后根据检测方法选择合适的抗体。一般使用HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗进行化学发光检测的方法。其它还有使用AP（碱性磷酸酶）标记抗体（对发光物质进行检测）、荧光物质及放射性同位素标记的二抗。23 使用二抗进行一抗的检测。二抗孵育前应进行点杂交预实验，研讨二抗的正确使用量。Western blot Western blot 快速检出试剂（二抗替代物）快速检出试剂（二抗替代物） - Western BLoT Rapid Detect v2.0 - Western BLoT Rapid Detect v2.024 短时间内有效

18、的进行抗体反应，可以使用Rapid操作方法提高检出感度，IgG Detector标记50个HRP分子增加信号强度。动物种HRP标记二抗替代物（检测Mouse IgG时需要使用Enhancer，不能替代goat IgG、human IgG3二抗）Western BLoT Rapid Detect v2.0T7122A50 次次3170 元元Western blotWestern blot步骤步骤25 检测化学发光检测检测检测( (化学发光化学发光 显色显色) )按照各试剂的操作流程进行重复操作，研讨最佳实验条件。将转膜后的膜放置在保鲜膜上，将检测试剂滴加在膜上，确保试剂均匀覆盖在膜上。因目的蛋白

19、的浓度和使用的抗体浓度不同，胶片曝光条件也不同，因此要进行预研讨实验。在发光持续时间内可改变胶片曝光条件进行多次检测。26 检测方法有化学发光法和显色法。显色法操作简便，但化学发光检测法检测灵敏度高，一般经常使用化学发光检测法。化学发光检测法是利用基质被二抗的HRP分解时生成的有色物对目的蛋白的有无及蛋白量进行检测。相关产品相关产品化学发光化学发光27 产品名称产品名称CodeCode包装量包装量价格价格（元）（元）检出灵敏度检出灵敏度概要概要检测方法检测方法Western BLoT Western BLoT ChemiluminescenceChemiluminescence HRP HRP

20、 SubstrateSubstrateT7101AT7101A250 ml250 ml1,6001,600pgpg级级其他公司同等产品其他公司同等产品发光强度比较发光强度比较X filmX filmWestern BLoT Western BLoT QuantQuant HRP HRP SubstrateSubstrateT7102AT7102A100 ml100 ml2,0502,050低低pgpg级级发光持续而稳定发光持续而稳定CCDCCD成像、成像、X X filmfilmWestern BLoT Western BLoT Hyper Hyper HRP HRP SubstrateSub

21、strateT7103AT7103A100 ml100 ml2,5002,500中中fgfg级级检出灵敏度的比较检出灵敏度的比较CCDCCD成像、成像、X X filmfilmWestern BLoT Western BLoT UltraUltra SensitiveSensitive HRP Substrate HRP SubstrateT7104AT7104A100 ml100 ml4,1304,130低低fgfg级级检出灵敏度和抗体检出灵敏度和抗体用量用量CCDCCD成像、成像、X X filmfilm28 发光强度比较发光强度比较28 Western BLoT Chemilumines

22、cent HRP Substrate（Code：T7101A）同其他公司同等HRP反应基质制品比较，利用HRP标记二抗（395,000 pg）进行slot blot检测发光信号。抗体：Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Peroxidase conjugated膜：nitrocellulose使用Western BLoT Chemiluminescent HRP Substrate可高灵敏度地检测出清晰的信号（曝光时间：5秒、X film。本公司数据） 明亮的发光信号29 发光持续而稳定发光持续而稳定29 稳定发光持续时间长使用Western BLoT Quant HRP Sub

23、strate（制品Code： T7102A）利用slot blot方法可以确认发光的持续性sample：人Transferrin ，200 ng起始2倍梯度稀释一抗 ：Goat anti-Human Transferrin Affinity Purified 二抗 ：Affinity Purified Antibody -Anti-Goat IgG(H+L) Peroxidase labeled 从反应开始从反应开始90min90min，发光还持续稳，发光还持续稳定，一次反应也可重复进行曝光定，一次反应也可重复进行曝光检测。检测。本公司数据30 检出灵敏度比较检出灵敏度比较30 使用少量抗体，

24、可进行高灵敏度检出HeLa细胞裂解液梯度稀释后作为样品，改变抗体使用量，western blot检测出GAPDH。sample ： HeLa细胞裂解液总蛋白，从10 g起始2倍梯度稀释一抗： Anti-Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, clone 6C5 （1 mg/ml） 二抗： Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Peroxidase conjugated （0.8 mg/ml） 使用Western BLoT Hyper Substrate（T7103A）更少的抗体量也可以检出本公司数据31 检出灵敏度和抗体使用

25、量检出灵敏度和抗体使用量Hela细胞裂解液梯度稀释的样品，SDS-PAGE电泳后，根据制品的灵敏度调整抗体稀释倍数，Western blot检出GAPDH。31 Sample ： HeLa细胞裂解液总蛋白，从10 g起始2倍梯度稀释 一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, clone 6C5（1mg/ml）（Merck Millipore） 二抗：Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Peroxidase conjugated （0.8 mg/ml） 使用使用Western BLoT Western BLoT

26、 Ultra SensitiveUltra Sensitive即使减少抗体使用量也可进行高灵敏度检测即使减少抗体使用量也可进行高灵敏度检测本公司数据32 检测增强剂检测增强剂32 适用于包括Western印迹和ELISA在内的各种免疫检测 可提高最终的检测灵敏度(从数倍到数十倍) 不影响辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)活性 兼容于交联二抗的酶和使用任何一种检测方法(如：比色检测法或发光检测法)检测检测Human TransferrinHuman Transferrin（各种抗体稀释液使用情况比较）（各种抗体稀释液使用情况比较）1TBS-T2Western BLoT Immuno B

27、ooster（code：T7111A）3A社反応促進試薬4Western BLoT Immuno Booster PF（code：T7115A）抗体稀释：抗体稀释溶液情况如下： Immuno Booster本公司数据33 检测系统检测系统33 生物发光检测生物发光检测 (冷光仪冷光仪) 系统系统详情请见：http:/ 重新标记重新标记34 lWestern进行了膜上的一抗及二抗的消除试剂l相对温和的条件下（室温，30分）的反应Western BLoT Stripping Buffer T7135A1 HeLa Cell Lysate 10 g 2 HeLa Cell Lysate 5 g 3

28、HeLa Cell Lysate 2 g 4 HeLa Cell Lysate 1.25 g 5 HeLa Cell Lysate 0.625 g 1 1-actin-actin検出（検出（第一次第一次抗原抗原 抗体抗体反应反应）Stripping （条件 : 室温、30分、0.25 ml/cm2 membrane ）2 2GAPDHGAPDH検出（検出（第二次第二次抗原抗原 抗体抗体反应反应）Stripping （条件 : 室温、30分、0.25 ml/cm2 membrane ）3 3-Tubulin-Tubulin検出（検出（第三次第三次抗原抗原 抗体抗体反应反应）4 4残存抗体検出残存

29、抗体検出Stripping （条件 : 室温、30分、0.25 ml/cm2 membrane ）本公司数据35 常见技术问答常见技术问答 有污渍或斑点，整体背景普遍偏高 出现白色条带 出现非特异性条带 信号弱或无信号 膜上部分无信号 条带扩散35 36 洗膜不充分 使用的膜有问题 封闭不充分 使用的封闭剂不适合 封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 实验器具有污染 缓冲液有污染 曝光时间过长 抗体浓度过高 HRP标记抗体发生凝集 使用杂交袋进行抗体孵育时，杂交袋内有残留气泡转膜转膜抗体抗体封闭封闭其他其他有污渍或斑点，整体背景普遍偏高有污渍或斑点，整体背景普遍偏高37 20132015201401

30、抗原、抗体检测检测 020203 蛋白 抗体量不充分 标记抗体失活 膜上的抗原分解 发光底物孵育时间过短 曝光时间过短 发光底物劣化 蛋白质转膜不成功 目的蛋白质量较差 蛋白制备过程中降解 膜上保存的蛋白质分解 目的蛋白blocking后被屏蔽洗膜、重新标记洗膜、重新标记信号弱或无信号信号弱或无信号Western BLoT Immuno BoosterWestern BLoT Immuno Booster（code T7111A）Western BLoT Rapid Detect v2.0Western BLoT Rapid Detect v2.0（code T7122A）其他常见问题其他常见

31、问题38 膜上部分无信号 转膜不完全出现白色条带出现白色条带抗体浓度过高出现非特异性条带出现非特异性条带 抗体浓度过高 SDS对蛋白质的非特异性吸附条带扩散条带扩散抗体浓度过高电泳用的蛋白量过高其他问题相关产品相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法TaKaRa BCA Protein Assay KitT9300A500 次700不受蛋白质种类的影响，在0.022 mg/ml浓度范围内蛋白质浓度与吸光度值成线性关系；对表面活性剂的干扰影响小；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）Bradford法TaKaRa Bradford Protein Assay KitT9310A500 次500操作简便，可快速地对浓度范围在11,000g/ml的蛋白质溶液进行定量。可对含有还原剂的样品进行测定；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）39 特别推荐特别推荐蛋白定量蛋白定量名称名称CodeCode包装量包装量价格（元）价格（元）优惠价（元）优惠价（元）TaKaRa BCA Protein Assay KitTaKaRa BCA Protein Assay KitT9300AT9300A500 500 次（次（1 ml1 ml）2500 2500 次（次（0.2 ml0.2 ml）