生物化学实验：SDS-PAGE

1、SDS-PAGESDS-PAGE电泳实验过程电泳实验过程 1. 准备玻璃板准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏：将玻璃板用蒸馏水洗净水洗净晾干晾干(实验室前后的空调实验室前后的空调吹干吹干)，把玻璃板在灌胶支架上固定好（，把玻璃板在灌胶支架上固定好（固定玻璃板时，两边用固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板，方向力一定要均匀，防止夹坏玻璃板，方向）。准备）。准备2个干净的个干净的100ml的烧杯；的烧杯；2. 配制分离胶配制分离胶：按比例（见：按比例（见SDS-PAGE 各部分凝胶配制）配好各部分凝胶配制）配好分离胶，用分离胶，用1ml移液器将胶液快速加入到玻璃板的夹缝中，移液器将胶液快速加入

2、到玻璃板的夹缝中，注注胶量约胶量约3ml3ml，高度约高度约5厘米（厘米（加至板夹上沿加至板夹上沿），之后迅速加少许，之后迅速加少许去离子水至满，静置去离子水至满，静置30分钟。分钟。凝胶配制过程要迅速，促进剂凝胶配制过程要迅速，促进剂TEMED要在注胶前再加入，要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程否则凝结无法注胶。注胶过程一次性完成一次性完成，避免产生气泡，避免产生气泡。 水封的目的是为了使分离胶上沿表面平直，并排除气泡水封的目的是为了使分离胶上沿表面平直，并排除气泡 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. .3.3.制备浓缩胶制备

3、浓缩胶：倒出分离胶上面的水，并用滤纸把剩余的水分吸：倒出分离胶上面的水，并用滤纸把剩余的水分吸干干, ,按比例（见按比例（见SDS-PAGE SDS-PAGE 各部分凝胶配制）配好浓缩胶，各部分凝胶配制）配好浓缩胶，连续平连续平稳稳加入浓缩胶至满加入浓缩胶至满, ,立刻插入样梳立刻插入样梳，静置静置3030分钟分钟. . 样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底需水平梳底需水平. .4.4.玻璃胶板的安装玻璃胶板的安装：将玻璃胶板固定到上样槽上，加入电极缓冲：将玻璃胶板固定到上样槽上，加入电极缓冲液，内槽距离顶端约液，内槽距离顶端约5 5mmmm，没

4、过短板，确保不漏液后拔出样梳。没过短板，确保不漏液后拔出样梳。 要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出, ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果. . 5. 5.加样加样（详见（详见7 7）各部分凝胶配制各部分凝胶配制分离胶分离胶(10% 5ml)浓缩胶浓缩胶(5% 3ml)H2O2.6ml1.7ml30%Acr1.7ml0.5mlBuffer3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.76ml10%SDS0.05ml0.02ml10%Ap0.05ml0.02mlTEMED3.0l3l6 6、样品预处理样品预处

5、理： 低分子量蛋白低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4Mark,E1,E2,E3,E4, ,牛血清白蛋牛血清白蛋白。白。 （1 1）低分子量蛋白）低分子量蛋白MarkMark、牛血清白蛋白和、牛血清白蛋白和E4E4的样品的样品由实验室提供。由实验室提供。（2 2）E1,E2,E3,E4E1,E2,E3,E4分别取分别取2020l l，再加入，再加入2020l 2l 2倍倍(2(2X) )样品缓冲液，在沸水中煮样品缓冲液，在沸水中煮3 3分钟分钟( (本次实验本次实验1 1个个E3E3、E4-1E4-1和和E4-2E4-2由实验室提供由实验室提供) )，点动离心除沉淀，点动离心除沉淀。7

6、 7、加样加样：用移液器向电泳道中加样，进样枪头要抵：用移液器向电泳道中加样，进样枪头要抵到泳道表面，但是到泳道表面，但是不要刺破胶的表面不要刺破胶的表面，进样要缓，进样要缓慢，不要使样品漂出泳道外面。慢，不要使样品漂出泳道外面。E1E1E2E2Mark牛血牛血清白清白蛋白蛋白E3E3E4-1 E4-220ul10ul 20ul 10ul 10ul10ul15ul15ul15ul15ul1108. 电泳过程电泳过程：将上样槽装入电泳槽，向电泳槽中加入电极缓冲液，接：将上样槽装入电泳槽，向电泳槽中加入电极缓冲液，接通电源，进行电泳。开始电流恒定在通电源，进行电泳。开始电流恒定在10mA（如果同时

7、电泳两块胶，如果同时电泳两块胶，电流恒定在电流恒定在20mA ），当样品在分离胶与浓缩胶之间被压成一条直），当样品在分离胶与浓缩胶之间被压成一条直线的时候，将电流改为线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在如果同时电泳两块胶，电流恒定在40mA ） ，电压设定在电压设定在220V。溴酚蓝距凝胶下边缘约溴酚蓝距凝胶下边缘约5mm时，停止时，停止电泳。电泳。9. 凝胶板剥离与染色凝胶板剥离与染色：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入特定：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入特定容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻璃板撬开，将凝胶容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻

8、璃板撬开，将凝胶做好做好标记标记，切除浓缩胶切除浓缩胶并冲洗后放在大培养皿内，加入染色液，染并冲洗后放在大培养皿内，加入染色液，染色色1小时。小时。10. 脱色脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不同纯化过程对杂蛋白去除状况。同纯化过程对杂蛋白去除状况。 剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒:低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛