分子生物学课件PCR

1、PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 模板DNA95PCR循环过程50引物1引物2DNA引物PCR循环过程引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR循环过程第1轮结束95第2轮开始PCR循环过程72TaqTaqTaqTaqPCR循环过程509572第2轮结束PCR循环过程模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增PCR循环过程第6轮扩增PCRPCR的反应动力学的反应动力学 PCRPCR的三个反应步骤反复进行，使的三个反应步骤反复进行，使DNADNA扩增量扩增量呈指数上升。平均扩

2、增效率的理论值为呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%100%，但，但在实际反应中平均效率达不到理论值。在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，反应初期，靶序列靶序列DNADNA片段的增加呈指数形式，随着片段的增加呈指数形式，随着PCRPCR产产物的逐渐积累，物的逐渐积累，被扩增的被扩增的DNADNA片段片段不再呈指数增不再呈指数增加加，而进入线性增长期或静止期，即出现，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞停滞效应效应”，这种效应期称这种效应期称平台期平台期。大多数情况下，大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增体系扩增体系模板模板 3TTAGG

3、CCTGGATAAGCGCCTGGA 5引物引物 5TCCGG C TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶底物底物 PCR PCR 反应体系反应体系PCRPCR反应五要素：反应五要素：引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和Mg2+Mg2+ 标准的标准的PCRPCR反应体系：反应体系：1010扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul10ul4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ug Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMg2+Mg2+ 1

4、.5mmol/L1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul100ul引物引物 引物是人工合成的引物是人工合成的两段寡核苷酸单链，两段寡核苷酸单链，是是PCRPCR特异性反应特异性反应的关键，扩增产物的大小也由的关键，扩增产物的大小也由特异引物限定。特异引物限定。3 3 设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则：引物引物长度长度： 15-30bp15-30bp，常用为，常用为20-27bp20-27bp左右。在做长片段左右。在做长片段PCRPCR或或做某些特殊的做某些特殊的PCRPCR时应使用较长的引物，但最多不超时应使用较长的引物，但最多不超过过5050个核苷酸个核苷酸引

5、物引物碱基碱基： G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜，过高或过低均不利于引为宜，过高或过低均不利于引发。发。ATGCATGC最好随机分布最好随机分布，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。避免引物自身互补避免引物自身互补，形成发夹结构，因空间位阻而，形成发夹结构，因空间位阻而影响其与模板结合。影响其与模板结合。两条引物间之间也不能互补两条引物间之间也不能互补，否，否则会形成则会形成引物二聚体引物二聚体，产生非特异的扩增条带或降低，产生非特异的扩增条带或降低引物有效浓度。引物有效浓度。引物引物33端的碱基端的碱基，应严格要求配对，应严格要求配对，不可修饰，不可修饰，

6、以避免因末端碱基不配对而导致以避免因末端碱基不配对而导致PCRPCR失败。考虑到失败。考虑到密密码子的简并性码子的简并性，引物，引物33端不终止于密码子第三个碱端不终止于密码子第三个碱基基。因该位置由于密码子的简并性影响扩增的特异性。因该位置由于密码子的简并性影响扩增的特异性。 引物的引物的5 5端可以修饰端可以修饰，它，它对扩增特异性影响不对扩增特异性影响不大。大。如增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；如增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入点突变、启动子序列等。引入点突变、启动子序列等。引物的引物的特异性特异性： 引物应该与引物应该与核酸序列数据库的核酸序列数据库的其它序列无

7、明显的其它序列无明显的同源性，同源性，以减少引物与基因组的非特异性结合。以减少引物与基因组的非特异性结合。简并引物简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列序列反推反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成合成多种序列的引物多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基彼此间只有一个或几个碱基差异差异。这样的。这样的混合引物称简并引物混合引物称简并引物。 简并性简并性(degeneracy)(degeneracy) 遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸

8、均有多个密码子。子外，其余氨基酸均有多个密码子。例如，例如， 序列序列1 1：tg tg a a atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列2 2：tg tg c c atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列3 3：tg tg t t atgcatgcatgcatgcatgcatgc 若样品并不能明确是若样品并不能明确是1 1，2 2还是还是3 3，为了能从不，为了能从不确定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的确定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引物实际上就是引物实际上就是针对序列针对序列1 1，2 2，3 3设计的混合物设计的混合物。这样不论

9、是这样不论是1 1，2 2还是还是3 3，采用你的引物均能有效扩，采用你的引物均能有效扩增。增。 套嵌引物套嵌引物 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。之间。增加扩增产物的特异性。1324 引物的溶解与保存：引物的溶解与保存： 引物量：引物量： DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 热稳定性热稳定性最大特点是最大特点是热稳定性热稳定性，耐高温，非常适合，耐高温，非常适合PCRPCR过程过程的反复高温变性要求。的反复高温变性要求。 最适温度高最适温度高最适温度：最适温度： 74-80 74-80 o oC (

10、PCRC (PCR延伸：延伸：7272-）延伸速度：延伸速度： 约约35-150nt/s.35-150nt/s.酶分子酶分子 最长延伸长度：最长延伸长度： 6.7kb6.7kb Taq酶的功能缺点酶的功能缺点具有具有5 53 3聚合酶活性和聚合酶活性和5 53 3外切酶活性，外切酶活性，但没有但没有3 35 5外切酶活性。外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！因此不能修复错误的碱基配对！ 合成超过合成超过600bp长度的长度的DNA就有可能出现错配，用就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。于克隆基因时必须测序。 金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是MgMg2+ 2+ ）。）。 1.

11、 1. 不同的公司或不同批次的产品常有不同的公司或不同批次的产品常有很大的很大的差异差异，由于酶的浓度对，由于酶的浓度对PCRPCR反应影响极大，因此反应影响极大，因此应当作应当作预试验或使用厂家推荐的浓度预试验或使用厂家推荐的浓度。 2. 2. 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少则合成产物量减少. .底物：底物：dNTPdNTP1. dNTP1. dNTP小量分装，小量分装，-20-20冰冻保存。冰冻保存。多次冻融会使多次冻融会使dNTPdNTP降解。降解。在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200umol/L

12、200umol/L，不能，不能低于低于101015mol/L15mol/L。浓度过高浓度过高，与与MgMg2+2+结合，使结合，使游离的游离的MgMg2+2+浓度降低，抑制浓度降低，抑制Taq DNATaq DNA聚合酶的活聚合酶的活性。性。浓度过低浓度过低又会降低又会降低PCRPCR产物的产量。产物的产量。2. 2. 尤其是注意尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等的浓度要相等( ( 等摩尔配制等摩尔配制) )，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。降低合成速度，过早终止反应。起错配。降低合成速度，过早终止反应。 模板模板( (

13、靶基因靶基因) )要求：要求：1. 1001. 100 l l反应体系中质粒反应体系中质粒DNA 1-10ngDNA 1-10ng，基因组，基因组DNA DNA 50-100ng 50-100ng 足够。足够。2. 2. 纯度要求不太严格，可以是粗品，纯度要求不太严格，可以是粗品，但不能混有但不能混有SDSSDS、有机溶剂酚、氯仿等、有机溶剂酚、氯仿等蛋白质变性剂蛋白质变性剂以及任何以及任何蛋白酶、核酸酶蛋白酶、核酸酶、Taq DNATaq DNA聚合酶抑制剂以及能结聚合酶抑制剂以及能结合合DNADNA的蛋白。的蛋白。 模板的种类：模板的种类：DNADNA或或RNARNA。1. RNA1. R

14、NA：先通过：先通过反转录得到反转录得到cDNAcDNA。2. 2. 质粒：线性化的比环状的效果好，但在实际质粒：线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做直接用做模板模板。3. 3. 高分子量高分子量的脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核的脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核糖核酸）做模板时，如果用糖核酸）做模板时，如果用适当的酶先进行消化适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。再作为模板，扩增效果会更好。Mg2+ Mg2+Mg2+对对PCRPCR扩增的特异性和产量有显著的扩增的特异性和产量有显著的影响。影响。 Mg2+ Mg2+可以可

15、以与与dNTPdNTP结合结合，易化，易化4 4种种dNTPdNTP的的协作，而且可以促进和稳定引物协作，而且可以促进和稳定引物- -模板的相互作模板的相互作用。因此，用。因此，Mg2+Mg2+浓度浓度过高，可出现非特异扩增过高，可出现非特异扩增。 浓度过低会降低浓度过低会降低Taq DNATaq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性，使反应产物减少。在一般的使反应产物减少。在一般的PCRPCR反应中，反应中，各种各种dNTPdNTP浓度为浓度为200200 mol/Lmol/L时，时，Mg2+Mg2+终浓度为终浓度为1.51.52.0mmol/L2.0mmol/L为宜。为宜。 PCRPCR反应条件

16、的选择反应条件的选择 基于基于PCRPCR原理三步骤而设置原理三步骤而设置变性变性- -退火退火- -延伸延伸三三个温度点。标准反应中采用三温度点法个温度点。标准反应中采用三温度点法 对于对于较短靶基因较短靶基因( (长度为长度为100100300bp300bp时时) )可采用可采用二温度点法，除二温度点法，除变性温度变性温度外、外、退火与延伸温度可退火与延伸温度可合二为一合二为一，一般采用，一般采用9494变性，变性，6565左右退火与左右退火与延伸延伸( (此温度此温度Taq DNATaq DNA酶仍有较高的催化活性酶仍有较高的催化活性) )。 - 温度与时间的设置温度与时间的设置变性温度

17、与时间变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全变性温度低，解链不完全是导致是导致PCRPCR失败失败的最主要原因。的最主要原因。 一般情况下，一般情况下，939394 1min94 1min足以使模板足以使模板DNADNA变性，若低于变性，若低于9393则需延长时间，则需延长时间，但温度但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。退火温度与时间：退火温度与时间： 退火温度与时间，取决于退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度成及其浓度，还有靶基因序列的长度。 TmTm值值( (解链温度解链温度)=)=4(

18、G+C)4(G+C)2(A+T)2(A+T)退火温度退火温度=Tm=Tm值值- (5- (510)10)在在TmTm值允许范围内值允许范围内，选择，选择较高的退火温度较高的退火温度可大可大大大减少减少引物和模板间的引物和模板间的非特异性非特异性结合。结合。 退火时间一般为退火时间一般为303060sec60sec，足以使引物与模板，足以使引物与模板之间完全结合。之间完全结合。 延伸温度与时间延伸温度与时间 Taq DNA Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性： 707080 150 80 150 核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 70 60 70 60 核苷酸核苷酸/S/S/

19、酶分子酶分子 55 24 55 24 核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 高于高于9090时，时， DNADNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行延伸温度一般选择在延伸温度一般选择在70707575之间，之间，常用温度为常用温度为7272。 反应时间，可据扩增片段的长度而定：反应时间，可据扩增片段的长度而定： 一般一般1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min足够。足够。 3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min； 10Kb 10Kb需延伸至需延伸至15min15min 循环次数循环次数 循环次数影响循环次数影响PCRPCR扩增程度。扩增

20、程度。PCRPCR循环次数主循环次数主要取决于要取决于模板模板DNADNA的的浓度浓度。一般为。一般为25-3025-30次，次，3535次次左右时，达到平台期左右时，达到平台期。循环。循环次数越多次数越多，非特异性非特异性产物的量亦随之增多产物的量亦随之增多。 PCR扩增产物分析扩增产物分析 1.1.凝胶电泳分析凝胶电泳分析：PCRPCR产物电泳，产物电泳，EBEB染色染色, ,紫外仪下紫外仪下观察观察.PCR.PCR产物片段的大小应与预计的一致。产物片段的大小应与预计的一致。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：通常应用：通常应用1 12%2%的琼脂糖的琼脂糖凝胶，供检测用。凝胶，供检测用。聚丙烯

21、酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：6 610%10%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳分辨率高，分辨率高，分离效果比琼脂糖好，条带分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，而且比较集中，而且DNADNA回收纯度高。回收纯度高。2. 2. 酶切分析酶切分析：根据：根据PCRPCR产物中限制性内切酶的位点，产物中限制性内切酶的位点，用相应的用相应的酶切、电泳分离后酶切、电泳分离后，获得，获得符合理论的片段，符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。能进行变异性研究。3. 3. 分子杂交分子杂交：如：如SouthernSouth

22、ern印迹杂交：在两引物之间另印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链，标记后做探针，与合成一条寡核苷酸链，标记后做探针，与PCRPCR产物杂产物杂交。此法既可作特异性鉴定，还可知其分子量。交。此法既可作特异性鉴定，还可知其分子量。4. 4. 斑点杂交斑点杂交：将：将PCRPCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探针杂交，薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于观察有无着色斑点，主要用于PCRPCR产物特异性鉴定及产物特异性鉴定及变异分析。变异分析。5.5.核酸序列分析：核酸序列分析：是是检测检测PCR

23、PCR产物特异性的最可靠产物特异性的最可靠方法。方法。 阳性对照阳性对照: : 是是PCRPCR反应是否反应是否成功、产物条带位置及大小成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。要的参考标志。PCR反应的关键环节有反应的关键环节有: 模板的制备，模板的制备， 引物的质量与特异性，引物的质量与特异性， 酶的质量及活性酶的质量及活性 PCR循环条件循环条件 PCR产物的电泳检测时间一般为产物的电泳检测时间一般为48h以以内，有些最好于当日电泳检测，大于内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后后带型不规则甚致消失带型不规则甚致消失 注意注意1、PCR常见问

24、题：常见问题： 出现非特异性扩增带出现非特异性扩增带 无特异性扩增带无特异性扩增带2、出现非特异性扩增带可能原因、出现非特异性扩增带可能原因 酶量过多酶量过多 Mg2+浓度过高浓度过高 dNTP浓度过高浓度过高 引物浓度过高，引物设计特异性差引物浓度过高，引物设计特异性差 模板纯度差模板纯度差 退火温度过低退火温度过低 循环次数过多循环次数过多片状拖带或涂抹带片状拖带或涂抹带 其原因往往由于酶量过多或酶其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，的质量差，dNTPdNTP浓度过高，浓度过高，Mg2+Mg2+浓浓度过高，退火温度过低，循环次数度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。过多引起。 对策：对策

25、： 减少酶量，或调换另一来源的酶。减少酶量，或调换另一来源的酶。 减少减少dNTPdNTP的浓度。的浓度。 适当降低适当降低Mg2+Mg2+浓度。浓度。 减少循环次数。减少循环次数。 假阴性假阴性 模板：模板：模板中含有模板中含有TaqTaq酶抑制剂酶抑制剂. . 提取制备提取制备模板时模板时丢失丢失过多，或过多，或吸入酚吸入酚. . 模板模板变性不彻变性不彻底底. .对策：配制有效而稳定的消化处理液对策：配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦其程序亦应固定不宜随意更改应固定不宜随意更改 酶失活酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因以分析是否因

26、酶的活性丧失或不够酶的活性丧失或不够而导致假阴性。而导致假阴性。（有时忘加有时忘加TaqTaq酶）酶）. .3. 3. 引物引物：引物的设计、质量、浓度、两条引物：引物的设计、质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是的浓度是否对称，是PCRPCR失败或扩增条带不理失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。想、容易弥散的常见原因。 对策为：对策为： 选定好的引物合成单位。选定好的引物合成单位。 引物的浓度不仅要看引物的浓度不仅要看ODOD值，值，更要注重引物原更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物而且

27、两引物带的亮度应大体一致。如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做有条带，一条引物无条带，此时做PCRPCR有可能有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。其浓度。 引物应引物应高浓度小量分装保存高浓度小量分装保存, ,防止多次冻融防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分或长期放冰箱冷藏部分, ,导致引物降解失效。导致引物降解失效。假阴性假阴性4.Mg2+4.Mg2+浓度浓度：浓度：浓度过高可降低过高可降低PCRPCR扩增的扩增的特异性特异性，浓度浓度过低则影响过低则影响

28、PCRPCR扩增产量，扩增产量，甚至使甚至使PCRPCR扩增失扩增失败而不出扩增条带。败而不出扩增条带。5.5.反应体积的改变反应体积的改变：在做小体积如在做小体积如20ul20ul后，再做大后，再做大体积时体积时，一定要模索条件，否则容易失败。，一定要模索条件，否则容易失败。6.6.物理原因物理原因：如变性温度低，变性时间短，极有可：如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性能出现假阴性; ;退火温度过低，可致非特异性扩退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率增而降低特异性扩增效率. .退火温度过高影响引退火温度过高影响引物与模板的结合而降低物与模板的结合而降低PCRPCR扩增效

29、率。扩增效率。7.7.靶序列变异：靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其物与模板失去互补序列，其PCRPCR扩增是不会成功扩增是不会成功的。的。 假阳性假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物。现象：空白对照出现目的扩增产物。 出现的出现的PCRPCR扩增条带与目的靶序列条带一致，扩增条带与目的靶序列条带一致，但其条带更整齐，亮度更高但其条带更整齐，亮度更高引物设计不合适：引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增选择的扩增序列与非目的扩增序列有序列有同源性同源性，因而可能扩增出的，因而可能扩增出的PCRPCR产物为非产物为非目的性的序列。目