实验三、质粒DNA的提取2

1、实验二实验二 质粒质粒DNADNA的分离提取的分离提取实验目的实验目的 了解碱法提取质粒的原理；了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。掌握碱法提取质粒的方法。实验原理实验原理 19461946年，美国科学家年，美国科学家LederburgLederburg 首先研首先研究了细菌的性因子究了细菌的性因子, ,并于并于19521952年由年由LederburgLederburg正式命名为质粒。正式命名为质粒。 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、双链复制能力的、双链DNADNA分子，大小可为分子，大小可为1kb1kb到到200kb200kb，

2、它随寄主细胞稳定遗传。，它随寄主细胞稳定遗传。质粒类型质粒类型质粒按复制方式分为两种类型：质粒按复制方式分为两种类型： 严紧型质粒严紧型质粒和和松弛型质粒松弛型质粒严紧型质粒严紧型质粒 复制要在蛋白质合成时和复制要在蛋白质合成时和DNADNA聚合酶聚合酶的存在，只随染色体的复制而复制，拷贝的存在，只随染色体的复制而复制，拷贝数少，每个细胞只有数少，每个细胞只有1 11010个。个。松弛型质粒松弛型质粒 松弛型质粒的复制需要松弛型质粒的复制需要DNADNA聚合酶聚合酶，在细胞生长周期中随时可以复制，每个细在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有胞中有1010200200个以上的拷贝，有的甚至个

3、以上的拷贝，有的甚至达到上千个。达到上千个。质粒的应用质粒的应用 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。用价值。 大多数基因工程使用松弛型质粒。大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。毒害致死的基因。三大要素：三大要素： 多克隆位点多克隆位点 选择标记选择标记 （耐药性，LacZ） 独立的复制单位独立的复制单位T-载体载体分离质粒分

4、离质粒DNADNA方法方法目前常用的目前常用的: :碱变性法碱变性法煮沸法煮沸法SDSSDS法法 羟基磷灰石层析法羟基磷灰石层析法碱变性法基本原理碱变性法基本原理 在在pH 12.0-12.6pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体菌染色体DNADNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNADNA仍为自仍为自然状态。然状态。 将将PHPH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体体DNADNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNADNA和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂S

5、DSSDS的作用下形成沉淀，的作用下形成沉淀，而质粒而质粒DNADNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体分细胞碎片、染色体DNADNA、RNARNA及蛋白质，质粒及蛋白质，质粒DNADNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒粒DNADNA。实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器 （二）（二） 材料材料 含含pGEX-4T-2pGEX-4T-2质粒的大肠杆菌质粒的大肠杆菌 JM109JM109。（三）（三） 试剂试剂 1

6、. LB1. LB液体培养基（液体培养基（1L1L） 胰蛋白胨胰蛋白胨 10g 10g 酵母提取物酵母提取物 5 g 5 g NaCl NaCl 10 g 10 g 加去离子水至加去离子水至800ml 800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用搅拌，使溶质完全溶解，用NaOHNaOH调调节节pHpH值至值至7.07.0，加入去，加入去 离子水至总体积为离子水至总体积为1 1升，高压蒸汽灭菌升，高压蒸汽灭菌20 20 分钟。分钟。 LBLB固体培养基（固体培养基（1L1L） 在上述在上述LBLB液体培养基（液体培养基（1L1L）中加入琼脂粉）中加入琼脂粉15g15g。 2. Solution 50 m

7、mol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA ( (pH 8.0) ) 高压灭菌后，高压灭菌后，44保存备用。保存备用。 3. Solution(现用现配制现用现配制) ) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 4. Solution 4. Solution （100 ml100 ml） 5mol/L KAc5mol/L KAc 60 ml 60 ml 冰醋酸冰醋酸 11.5 ml 11.5 ml 水水 28.5 ml 28.5 ml 配制成的溶液配制成的溶液含含3 mol/L3 mol/L钾盐、钾盐、5 mol/L5 mo

8、l/L醋酸醋酸 （pH 4.8pH 4.8）。）。 5. 5. 氨苄青霉素（氨苄青霉素（AmpAmp） 用无菌水配制成用无菌水配制成100 mg/ml 100 mg/ml 溶液，置溶液，置-20-20冰箱保存冰箱保存备用。备用。 6. 6. 胰胰RNARNA酶酶 将胰将胰RNARNA酶（酶（RNA RNA 酶酶 A A）溶于）溶于10 10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L 15 mmol/L NaClNaCl中，中， 配成配成10 mg/ml10 mg/ml的浓度，于的浓度，于100100加热加热1515分钟，缓

9、慢冷却至室温，分分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于装成小份保存于-20-20。 7. 7. 氯仿，乙醇氯仿，乙醇 ，70%70%乙醇。乙醇。质粒提取的实验步骤质粒提取的实验步骤 1. 1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB50ml LB液体培养基（含液体培养基（含Amp Amp 0.1 mg/ml 0.1 mg/ml ）中，）中，3737振荡培养过夜；振荡培养过夜； 2. 2. 将菌液倒入将菌液倒入1.5 ml Eppendorf1.5 ml Eppendorf管中，管中，10,000 rpm10,000 rpm离心离心3030秒，秒，去掉上清液，重复两次

10、；去掉上清液，重复两次； 3. 3. 加入加入100L SolutionI100L SolutionI 漂洗沉淀，倒尽液体；漂洗沉淀，倒尽液体； 4. 4. 加入加入100L 100L 用冰预冷的用冰预冷的SolutionISolutionI, , 涡旋使沉淀充分悬浮，室涡旋使沉淀充分悬浮，室温放置温放置5 5分钟；分钟； 5. 5. 加入加入200L SolutionII200L SolutionII，混匀（快速颠倒混匀，混匀（快速颠倒混匀3030次，注意动次，注意动作轻），室温放置作轻），室温放置2min2min。 6. 6. 加入加入150L150L用冰预冷的用冰预冷的SolutionI

11、IISolutionIII，温和颠倒混匀（注意动，温和颠倒混匀（注意动作轻）作轻） ，冰浴放置，冰浴放置2 25min5min。 7. 12,000rpm7. 12,000rpm，离心，离心10min10min，将上清移至，将上清移至1 1个新个新EppendorfEppendorf 管中，注意所取体积（约管中，注意所取体积（约400 L 400 L ） 。 6. 6. 加入等体积氯仿（约加入等体积氯仿（约400 L 400 L ），混匀（注意动作），混匀（注意动作轻）。轻）。12,000rpm12,000rpm，44，离心，离心10min10min，取上清液。，取上清液。 7. 7. 上清液

12、中加入预冷的等体积异丙醇，上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20-20沉淀沉淀 2030 min2030 min。 8. 12,000 rpm8. 12,000 rpm离心离心15 min15 min。 9. 9. 去上清，沉淀加入去上清，沉淀加入500L 70%500L 70%乙醇洗涤乙醇洗涤2 2次次（ 12,000 rpm12,000 rpm离心离心3 3分钟）。分钟）。 10. 10. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。燥沉淀。 11. 11. 每管中加入每管中加入25L25L无菌水无菌水1L RNase1L RNase， 3737

13、溶溶解质粒解质粒DNADNA。实验结果及讨论实验结果及讨论 碱法提取质粒的注意事项碱法提取质粒的注意事项试剂盒操作方法【实验步骤【实验步骤】1、将培养好的、将培养好的12 ml细菌细菌12,000 rpm离心离心2min，去上清。，去上清。2、加、加250 l Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3、加入、加入250 l Solution II，立即上下颠倒，立即上下颠倒510次，使细菌裂解，室次，使细菌裂解，室温放置温放置2分钟。分钟。4、加入、加入 400 l Solution III，立即上下颠倒，立即上下颠倒510次，使之充分中和，次，使之充

14、分中和，室温放置室温放置2-4分钟。分钟。5、12,000 rpm离心，离心，10分钟。分钟。6、将步骤、将步骤5中的上清转移到套放于中的上清转移到套放于2.0 ml收集管内的收集管内的spin column柱柱中，中，12,000 rpm室温离心室温离心60秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。入同一个收集管中。7、向吸附柱中加入、向吸附柱中加入500微升的微升的Rnase A, 12,000rpm离心离心30秒。倒掉秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。8、向吸附柱中加入向吸附柱中加入700微升的微升的Rnase B, 12,000rpm离心离心30秒。秒。