现代生化药学

1、. 现代生化药学复习提要  2009年12月使用  第一章 PCR1 PCR的英文全称是什么? Polymerase Chain Reaction2 PCR是谁发明的？Kary Mullis3 PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理，是以拟扩增的DNA片段为模板，以一对分别与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板DNA链延伸，直至新的DNA合成。不断重复这一过程，则可使目的DNA片段得到扩增。4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？PCR反应中一般会产生2种不同长度的产物：一种

2、是预期长度的产物，一种是比预期长度长得多的产物；前者以指数级数增加（2n），后者以几何级数增加（2n）。因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？模板：待扩增的DNA或RNA；引物：与靶DNA的3端和5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的5端决定了扩增产物的5端位置。说明引物决定了扩增片断的长度、位置和结果。6 PCR反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？基因组DNA、噬菌体DNA、质粒DN

3、A、cDNA、mRNA、预先扩增的DNA均可作为模板。PCR反应对模板质量要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的DNA可以作为模板，但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂和任何可以结合DNA的蛋白质；虽然片段长短不是影响PCR效率的关键因素，短片段模板PCR效率更高；为保证反应的特异性，应使用ng级的克隆DNA、g级的单拷贝染色体DNA、或104拷贝的待扩增片段。7 什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？引物是与靶DNA的3端和5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。

4、8 引物设计的基本原则有哪些？a. 引物长度一般在2024bp：这样长度的引物保证了不易形成杂合体；b. （G+C）%：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列的时候应与模板的相近。c. 引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构；d. 两引物不可配对；e. 引物3端为DNA聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此应严格、准确地配对。9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？a. Klenow片段：为DNA聚合酶的片段，具有聚合酶活性和35外切酶活性；b. Taq酶：耐热DNA聚合酶，可耐受9395摄氏度，是PCR普及的关键。它避免了不断补加DNA聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减

5、少了非特异性产物和DNA二级结构的影响，提高了PCR的特异性、敏感度和产量。它没有35外切酶活性，无校对功能。c. Stoffel片段：第二代耐热DNA聚合酶，将97.5摄氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；对复合PCR（2个或以上模板位点的PCR）更有效；d. Vent酶：耐受100摄氏度以上高温达2h；具有校对功能。e. RTth 逆转录酶：有依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，这两种活性分别依赖于Mn2+和Mg2+。10 PCR反应中对于加入的dNTP有什么要求？dNTP应具有一定浓度：浓度过高会抑制Taq酶活性，较低浓度可降低错误掺

6、入，浓度过高会导致错误掺入，浓度过低会导致产量过低；4种dNTP应有一样的浓度，否则会诱导聚合酶错误掺入而降低产率、提前终止反应；不能反复冻融，否则会降解。11 PCR反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，因为耐热DNA聚合酶需要游离的二价阳离子作为辅助离子，它影响着PCR的产量和特异性。常用Mn2+和Mg2+。12 PCR反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特点？A变性：双链DNA变成单链DNA。变性温度的高低由G、C含量决定；变性时间由DNA链长度决定。常规PCR变性条件为9495度45s。B 退火：指单链DNA与引物特异性结合。退火温度太高则

7、效率低，退火温度太低则出现非特异性复性。C 延伸：寡核苷酸的延长，一般在耐热DNA聚合酶的最适温度下进行。对于Taq酶，为7278度。13 什么叫PCR的反应平台？形成的原因可能是什么？PCR反应不是无穷的进行，到了PCR后期，当产物达0.31pmol/L时，产物不是呈指数增长而是进入平台期，曲线由指数曲线变为平坦。形成原因：由于引物和dNTP的减少，Taq酶失活；或由于底物过剩、非特异性产物的竞争、变性时解链不完全、退货时产物单链自行缔合、最终产物的阻化作用。14 提高PCR反应的特异性一般可以使用哪几种方法？a. 引物设计：引物长度，G+C含量，退火温度，引物浓度与纯度，稳定性；b. 使用

8、热启动：在变性完成之后再加入DNA聚合酶，这样可以提高特异性，因为DNA聚合酶在低温时也有活性。c. 镁离子浓度：不同的模板和引物有不同的镁离子浓度，应进行预实验进行探索；较高的镁离子浓度会提高产量，同时降低特异性；dNTP浓度较高时应适当提高镁离子浓度。d. 促进PCR的添加剂：影响DNA溶解温度的添加剂可提高特异性和产率；e. 使用巢式PCR：降低扩增多个靶位点的可能性，提高特异性15 常用的促进PCR特异性的试剂有哪些？甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱，PCRx Enhancer Solution。16 什么是热启动？在模板DNA完全变性后再加入DNA聚合酶（或使DNA聚合酶有活性）的方法

9、，可减少低温下DNA聚合酶活性造成的非特异性扩增。17 RACE的全称是什么？Rapid Amplification of cDNA Ending（cDNA末端的快速扩增）18 什么叫定量PCR？利用PCR反应来测定样品中的DNA或RNA的原始拷贝数量。利用每一个循环都能测得PCR产物的增生来获得反应饱和前的资料。19 为什么PCR中对产物进行终点检定量不准确？随着PCR的进行，反应体系中的引物、dNTP，甚至模板都会供不应求，导致PCR的效率下降，产物产生的越来越慢。直到Taq酶都被饱和后，反应就进入平台期。在实际实验中，由于各种条件的相互影响，每个反应进入平台期的时间不同，导致终产物浓度各

10、不相同。即使是重复实验，也不可能做到同时进入平台期。因此反应终产物与原始拷贝数无线性关系，定量不准确。20 什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何确定的?Cycle threshold（Ct）：每个反应管内的荧光达到阈值时的循环数，即在PCR中，荧光信号开始由本底进入指数增长的拐点处所对应的循环数。21 简述Taqman探针技术的原理。TaqMan技术原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常2030bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光

11、信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数>。但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同

12、波长的荧光，都会使得本底偏高22 解释下列各种PCR的基本原理： (1) RT-PCR  （Reverse Translation-PCR）将反转录与PCR结合的技术，以便利用mRNA扩增得到cDNA。RNA的提取：用异硫氰酸胍-酚-氯仿提取细胞中的RNA；mRNA的提取：亲和层析法；RT：在反转录酶的作用下，将mRNA反转录为cDNA第一链，namely以oligo（dT）、随机六聚寡核苷酸或基因特异序列为引物，与mRNA结合之后，在反转录酶的作用下延伸合成cDNA第一链；PCR：设计基因特异的上下游引物，其中上游引物与cDNA第一链复性后延伸合成cDNA第二链，再以cD

13、NA第一链和第二链为模板，用上下游引物进行PCR。(2) 多重PCR  用于检测多个基因的表达，且这些基因都与某一疾病的检测、治疗或预后有关。多重PCR与常规RT-PCR的不同点在于：在反转录过程，前者使用Oligo（dT）或随机六聚寡核苷酸为引物，而不用基因特异性引物；在PCR过程，前者需要设计多对引物，以扩增多个基因表达产物。(3) 3'-RACE A反转录获得3末端第一链cDNA：3末端本身具有PolyA，可以与引物结合。引物也同样具有oligo(dT)，但这种引物在5端有OP（Outer Primer）和IP（Inner Primer）的特殊结构，便于为以后的两轮PC

14、R提供引物；在3端加入一个锚定核苷酸，可以使反转录在紧接着PolyA的交界处进行，这样可以有效减少同聚物的产生。B第一链cDNA3端的扩增：设计两种引物GSOP和GSIP。由于cDNA已含有外源性OP和IP序列，故可以用来自目的基因的GSOP和来自锚定序列的外源性OP进行第一轮扩增，用GSIP和IP进行第二轮扩增，以此增强特异性。(4) 简并PCR  一般PCR根据确定的核苷酸序列设计引物，简并PCR一般用于已知氨基酸序列而不知道核苷酸序列的情况。根据氨基酸密码子的简并性，设计一个包含多个核苷酸序列的引物库，以扩增出未知序列的核苷酸。这些引物有很多相同碱基，但也有碱基不同，这样保证了

15、和多种同源序列发生退火。(5) 不对称PCR是一种用不对称的引物进行PCR的方法，分为引物浓度不对称PCR和引物长度不对称PCR。结果是产生大量的单链DNA，又避免了在检测时要先出去剩余引物的操作。引物浓度不对称PCR：两引物的浓度不同，其中浓度低的为限制性引物，起决定性作用，只有当限制性引物耗尽后才会开始大量产生ssDNA。常规热不对称PCR（常规引物长度不对称PCR）：将限制性引物的退火温度设计得比非限制性引物低至少10度。在刚开始的1015个循环中，退火温度略低于限制性引物的退火温度，产生双链DNA，以耗尽限制性引物；之后的退火温度便以非限制性引物的退火温度为准，大量产生单链DNA。交错

16、式热不对称PCR(6) 竞争性PCR  首先将mRNA逆转录为cDNA，然后在扩增体系中加入浓度已知的竞争性参考模板，这两种模板都可以与引物竞争性结合，但产物可因大小不同或酶切位点不同而可以区分开。之后在凝胶电泳上测定两种产物的浓度后即可推断mRNA的初始浓度。(7)巢式PCR   由两轮PCR和两套引物组成。首先对靶基因进行一次扩增，将扩增产物提取后进行第二次扩增，此时的结果即为目的产物。这样可以提高特异性和灵敏性。(8) 降落PCR(touch-down PCR)一般用于PCR温度条件的摸索。退火温度起始于高于计算值15度，之后每过一个循环，温度降低12度。由

17、于正确和非正确的退火温度造成的产量是指数级的，因此可以使正确产物得到累计。当温度降低到非特异性退火温度时，就会发生非特异性结合，但此时的特异性结合产物已经累计了一个几何级数的优势，因此非特异性结合产物的量不会很多。第2章 放射性同位素知识和应用1 什么叫“核衰变”？放射性同位素的原子核很不稳定，会持续不断的自发放出射线，直到变成另一种稳定同位素。2 什么叫半衰期？特点是什么？放射性同位素的半衰期：一定数量的放射性同位素原子数目减少到原来一半时所需要的时间。半衰期越长，说明衰变的越慢；反之越快。半衰期是放射性同位素的特征参数，不同的放射性同位素有不同的半衰期。3 分子生物学实验室常用的几种放射性

18、同位素有哪几种？他们的半衰期分别是多少？4 什么叫放射源？用放射性物质制成的，能产生辐射照射的物体。5 什么叫同位素示踪法？有什么优点？利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法。灵敏度高、方法简便、定量定位准确、符合生理条件。6 同位素示踪法中使用的同位素是哪种同位素?7 什么叫同位素效应？8 举例说明同位素示踪法在分子生物学核生物化学中的应用。9 放射性测量的原理是什么？探测仪可以分为哪2类？放射性同位素发出的射线与物质相互作用，会直接或间接产生电力和激发等效应，以此探测放射性的存在、强度和放射性同位素的性质。分为径迹型和信号型。10 闪烁计数器的工作原理是什么？闪烁型探测器

19、由闪烁体-光电倍增管-放大器-分析器-定标器组成。闪烁体吸收射线后发出光信号，被光电倍增管收到而发生光电效应，转化成电信号并逐级放大，最后被定标器记录下来。放射性同位素越多，发出的光信号越多，电信号也越多。11 什么叫闪烁体？一类能吸收能量，并在1微秒内甚至更短将能量以光的形式发射出来的物质。12 液体闪烁计数器和晶体闪烁计数器分别适合检测什么样的放射性线？液体闪烁计数器和晶体闪烁计数器分别适合检测什么样的放射性线？液体闪烁计数器适合检测-ray和低能-ray；晶体闪烁计数器适合-ray。13 人体各种器官中，对辐射最为敏感的是什么器官?14 什么叫细胞的间期死亡？增殖死亡？细胞的间期死亡：细

20、胞受辐射照射后，不经分裂，在几小时内死亡。两类细胞发生间期死亡一类是不分裂或分裂能力有限的细胞，如淋巴细胞和胸腺细胞；另一类是不分裂或可逆性分裂的细胞，如成熟神经细胞、肝细胞、肾细胞等。增殖死亡：细胞受辐射照射后，经1个或几个分裂周期后，因失去增值能力而死亡。主要是由于DNA分子损伤后错误修复和染色体畸变等原因造成有丝分裂障碍。15 什么叫外照射？内照射？辐射的确定性效应？随机效应？外照射：辐射源由体外照射人体。生物效应强。如-ray、中子、X-ray。内照射：放射性物质通过某种途径进入人体，以其辐射能产生生物效应者为内照射。如ray。辐射的确定性效应：辐射的严重程度与照射剂量的大小有关，效应

21、的严重程度取决于细胞群中受损细胞的数量或百分率。如白细胞减少、皮肤红斑脱毛、白内障。随机效应：效应的发生率与照射剂量的大小有关，这种效应在个别细胞损伤时即可出现，无阈剂量。如诱发癌症和遗传效应。16 放射防护的3原则是什么？放射实践正当化；放射防护最优化；个人剂量限制。17 外照射防护的基本措施是什么？时间防护、距离防护、屏障防护。18 放射性的“三废”是指哪三废？放射性废气、废液、固废。19 外照射的，和伽马射线应该分别如何防护？20 医院中使用的X光机中有没有辐射源？为什么？ 没有密封源。是由X线管发出，X线管由真空玻璃管中的阳极和阴极组成，其中阴极为钨丝。 第3章 分

22、子杂交技术1 核酸分子杂交的分子基础是什么？2 举例说明哪些生物反应是属于探针靶反应？3 核酸探针的种类有哪些？各有什么特点？4 探针标记技术可以分为哪两类？5 核酸探针常用的酶促标记技术有哪几种？6 缺口平移标记技术的原理是什么？利用了什么酶的哪些？7 DNA快速末端标记中使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？8 标记DNA 5'末端时使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？与DNA快速末端标记中使用的有什么不同？9 核酸的非放射性标记技术可以分哪几类？10 常用的非放射性标记系统中，有哪几种常用的非放射性物质可用来标记核酸分子？11 Souther杂交的过程一般分为哪几步骤？

23、12 预杂交的作用是什么？13 核酸分子杂交实验的优化一般可以从哪几个方面考虑？ 第4章 cDNA文库1 什么叫基因组文库？cDNA文库？有什么区别？2 构建一个理想的cDNA文库需要考虑的因素有哪些？3 如何考察确定一个cDNA文库的质量？4 什么叫文库的代表性？5 什么叫文库的库容量？有什么意义？6 常用来构建文库使用的载体系统有哪些？各有什么特点？7 构建cDNA文库的基本步骤有哪些？8 对cDNA文库进行筛选的策略有哪两种？1.以一个已知的分子作为靶标,通过检测在特定条件下文库与靶标发生相互作用的基因序列或其编码的表达产物,从而分离出目的基因.这是筛选cDNA文库最常用的策略

24、.前提是必须首先确定出一个可作为靶标的分子.2.不需要附加任何先决条件,而是通过检测在特定条件下来源于两个文库的基因编码产物之间相互发生作用的情况,从而确定出这两个文库中所有可能在生理上发生相互作用的基因对,描绘出某一特定类型细胞内表达出的基因之间发生的基因相互作用的联络图.不仅有助于确定各种基因在细胞生命活动中的具体功能,还能研究功能基因组学.9 使用核酸杂交方法筛选cDNA文库时使用的探针有哪几种？1.同源探针2.简并性寡核苷酸探针3.cDNA探针10 对表达文库进行高通量的功能性筛选有哪几种方法？1.噬菌体表面展示系统2.酵母双杂交系统3.酵母单杂交系统11 噬菌体表面展示技术的原理是什

25、么？利用大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体(fd或M13)作为载体,在重组噬菌体颗粒表面展示外源多肽分子.外源蛋白在噬菌体表面上展现,是通过外源蛋白在宿主大肠杆菌分泌性表达过程中与丝状噬菌体外膜结构蛋白(如主要外膜蛋白P8和次要外膜蛋白P3)形成牢靠的复合物而得以实现.方法一:通过基因重组操作,构建外源基因与噬菌体外膜蛋白基因的融合基因,直接产生出外源蛋白与外膜结构蛋白的嵌合分子.方法二:在表达基因的构件上,分别使表达出的噬菌体结构蛋白P3或P8的N端和外源蛋白的C端分别融合上一种短的介导蛋白质相互作用的功能结构域.12 酵母双杂交系统的原理和主要功能是什么？一般由哪几部分组成？原理:在这一系统中,

26、与诱饵蛋白融合的DNA-BD和与文库猎物蛋白融合的AD均来自GAL4相应的结构域.将诱饵蛋白与猎物蛋白的编码质粒分别导入同一个GAL4缺失的酵母细胞中,通过两种相互作用蛋白结合形成复合物,可以重建GAL4的活性,转录激活相应的效应基因.三个基本组成部分:1.编码靶蛋白与DNA结合域融合蛋白的表达质粒.这种靶蛋白在双杂交系统中专称诱饵蛋白;2.cDNA质粒表达文库,文库cDNA表达出的蛋白与转录激活域形成融合蛋白,这些蛋白统称为猎物蛋白;3.能反映出体内转录因子活性重建的宿主酵母菌及体现出这种活性的报道基因系统.13 酵母双杂交体系常常出现假的阳性结果，应该如何正确判读得到的结论呢？14 酵母单

27、杂交系统的原理和主要功能是什么？  第6章 大肠杆菌表达系统1 使用大肠杆菌表达系统表达外源基因有哪些优点？与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目标基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强2 质粒表达载体一般包括哪些主要的组成部分？A复制子：复制子是一段包含复制起始位点、反式因子作用区在内的DNA片段，其功能是通过复制使得质粒能稳定存在于大肠杆菌内。B筛选标记：质粒表达载体上，必需含有表型选择标记，才能把已成功转化的大肠杆菌从大量的菌群中分理处理啊，表型选择标记分为显性标记和营养缺陷型标记。大肠杆菌表达系统都采用抗生素抗性基因作为显性选择标记。C启动子：在

28、大肠杆菌表达系统中，大部分表达载体采用调控型启动子控制目标基因的表达。这种能控制基因在特定时期表达的模式既可避免菌体生长前期目标基因的高表达对菌体生长的影响，又可减少细菌的蛋白水解酶对目标基因产物的降解。这对于建立一个高效、实用的表达系统十分重要。D终止子：位于启动子的上游转录终止子，可以防止由质粒上其他基因启动子产生的通读作用，以降低诱导前的本底表达。位于启动子的下游转录终止子既可以控制目的基因mRNA的长度，提高其稳定性，又能避免质粒上其他基因的异常表达导致高拷贝质粒的稳定性下降的缺陷。E核糖体结合位点：紧靠启动子下游，翻译起始密码子ATG通常位于它的中心位置，含有SD序列，与rRNA 1

29、6S亚基互补。3 质粒表达载体中一般在什么位置使用终止子？位于启动子的上游转录终止子，可以防止由质粒上其他基因启动子产生的通读作用，以降低诱导前的本底表达。位于启动子的下游转录终止子既可以控制目的基因mRNA的长度，提高其稳定性，又能避免质粒上其他基因的异常表达导致高拷贝质粒的稳定性下降的缺陷。4 使用简明的语言叙述Lac/Tac表达系统、PL和PR表达系统以及T7表达系统的主要特点。表达系统表达载体宿主菌诱导方法控制本底的方法Lac和Tac野生型lac操纵子：受正调节因子CAP和负调节因子lacI调控lacUV5突变体可以在没有CAP存在的情况下非常有效的起始转录,只受lacI阻遏调控tac

30、启动子调控模式与lacUV5模式相似,但mRNA转录水平更高,具有更高的基因表达水平大肠杆菌JM 109等基因型为lacIq的菌株化学诱导：IPTG、乳糖、异乳糖当多拷贝的lac表达质粒转化进入大肠杆菌,不能保证有足够的阻遏蛋白,因此具有较高的本底.可采用lacI基因突变体lacIq为宿主菌,它可以产生过量的阻遏蛋白;还可在表达载体中插入lacIq基因PL和PR野生型噬菌体: PL和PR启动子受cI基因的产物阻遏选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控,高温失活溶源化噬菌体的肠杆菌热脉冲诱导一,采用溶源化噬菌体的肠杆菌;二,将cI857ts基因组装在表达载体上T7T7噬菌体基因1编

31、码的T7 RNA聚合酶(高活性)选择性激活T7噬菌体启动子的转录,根据T7 RNA聚合酶的转录调控模式决定表达系统的调控方式化学信号诱导；热脉冲诱导；贫氧诱导如果目的基因对大肠杆菌宿主有毒性,会影响细胞的生长,可以在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因,溶菌酶可以与T7RNA聚合酶结合以抑制其转录活性5 使用大肠杆菌表达外源基因时，产生的蛋白质在大肠杆菌体内有哪几种形式？各有什么特点？PS包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需要，无法形成正确的构象而产生的。包涵体颗粒：在细胞内表现为不溶性的，存在于大肠杆菌的细胞质中。优点是能够表达对大肠杆

32、菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白；能够避免细胞内蛋白水解酶的作用和有利于目标蛋白的富集和分离纯化。缺点：包涵体要用变性剂溶解，经过复性过程才能得到在缓冲溶液中溶解的蛋白质；经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白质。复性处理工艺会使目标蛋白的制备成本上升。可溶性蛋白：在细胞内表现为可溶性的，除可存在于细胞质中，还可最终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。优点：可避免包涵体复性带来的问题缺点：大肠杆菌细胞质环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成，并且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构想的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往

33、往不能正确折叠。并且分离纯化较复杂。6 使用大肠杆菌表达外源基因时，产生的蛋白质在大肠杆菌体中的位置有哪几种？各有什么特点？细胞质：表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量；在细胞质内表达的目标蛋白往往形成包涵体颗粒。周质空间：自身蛋白质的数量少，蛋白水解酶的含量也相比少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生。目标蛋白在周质空间中能够较好折叠，维持正确的构象。信号肽序列在目标蛋白由细胞质转运至周质空间有重要作用。培养基：可以进一步减少蛋白水解酶的降级，也有利于分离纯化，但对外泌分子量较小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比较低。 7 如何在大肠杆菌中高效表达外源基因？可以从哪几个方面考虑？A. 表达质粒的优化设计：核糖体结合位点对于构建高效表达质粒至关重要。它序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，构建表达质粒时，首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。另外，核糖体结合位点本