基因工程药物制备技术ppt课件

1、基因工程药物基因工程药物制备技术制备技术 一、实验目的一、实验目的 经过本实验了解和掌握基因工程经过本实验了解和掌握基因工程蛋白药物的发酵表达、提取、纯化蛋白药物的发酵表达、提取、纯化及纯度检测等根本方法及纯度检测等根本方法二、实验原理本实验工程菌在含卡那霉素的LB培育基中，在IPTG诱导下可大量表达重组蛋白。重组蛋白以无活性、不溶性的包涵体方式存在。要获得活性蛋白，必需进展变性、复性处置。重组蛋白N端存在6个延续的组氨酸His序列，可与镍进展可逆鳌合反响，因此，可用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA进展亲合纯化，以镍柱亲合层析法获得纯化的重组蛋白。工程菌培育工程菌培育破菌破菌诱导表达诱导表达包涵体

2、制备包涵体制备变性变性复性复性重组蛋白纯化重组蛋白纯化亲和层析亲和层析紫外分光光紫外分光光度计检测度计检测三、实验器材三、实验器材恒温震荡培育箱、超净任务台、天平、高速恒温震荡培育箱、超净任务台、天平、高速冷冻离心机、制冰机。、超声波细胞破碎冷冻离心机、制冰机。、超声波细胞破碎仪、仪、ompW ompW 重组大肠杆菌、试剂、玻璃器重组大肠杆菌、试剂、玻璃器皿等皿等四、实验内容四、实验内容1、实验设计及菌种活化、实验设计及菌种活化实验整体设计方案确实定实验整体设计方案确实定 培育基及溶液的配制培育基及溶液的配制工程菌接种培育工程菌接种培育配制溶液配制溶液 每组试管、三角烧瓶培育基各一份；每组试管

3、、三角烧瓶培育基各一份；PBS全班全班2升；升； 培育基灭菌后加卡那培育基灭菌后加卡那霉素。霉素。菌种活化菌种活化 取菌种接种于取菌种接种于10ml的的LB培育培育基中试管，基中试管，37，190r/min摇床摇床培育过夜。培育过夜。溶液配方溶液配方1LB培育基培育基1L 蛋白胨蛋白胨 10g 酵母膏酵母膏 5g NaCl 10g 用用 NaOH溶液调溶液调pH至至7.4，高压灭菌。，高压灭菌。2卡那卡那/LB液体培育基中，按终浓度液体培育基中，按终浓度50g/ml参与参与卡那霉素母液浓度为卡那霉素母液浓度为0.25g/ml3PBSpH7.41L NaCL 8g KCL 0.2g Na2HPO

4、4 1.44g KH2PO4 0.24g 用用 HCL调理溶液的调理溶液的pH至至7.4，高压灭菌后，保管，高压灭菌后，保管于室温。于室温。2、 工程菌的发酵培育及诱导表达工程菌的发酵培育及诱导表达实验内容实验内容工程菌的发酵培育工程菌的发酵培育诱导表达外源蛋白诱导表达外源蛋白离心搜集菌体离心搜集菌体配制液体配制液体实验操作实验操作1摇瓶发酵表达摇瓶发酵表达 将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，37，190r/min摇菌培育摇菌培育34小时，参与小时，参与IPTG至至终浓度为终浓度为1mmol/L母液母液0.1mol/L，37诱导表达诱导表达3-4小时。小时。2菌体

5、搜集菌体搜集诱导表达终了后，诱导表达终了后，4 10000rpm离心离心10min，PBS缓冲液清洗一次后同样条件离心后再缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次搜集菌体。次搜集菌体。-20保管备用。保管备用。3 3配制包含体洗涤液明天用配制包含体洗涤液明天用包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液I I：包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液II II：包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液IIIIII：变性液变性液300mL)300mL)变性液：变性液： 100MLTris 1.2114gEDTA 0.0584g2-硫苏糖醇硫苏糖醇 0.154 g 尿素尿素 48.048g HCl 调至调至pH 7.5包含体洗涤缓

6、冲液包含体洗涤缓冲液I：1LTris 6.057g浓浓HCl 2mLEDTA 0.584gNaCl 5.85gTriston X-100 5 mL尿素尿素 240.24g包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液II 1LTris 6.057g浓浓HCl 2mL EDTA 0.584g NaCl 5.85g Triston X-100 3mL包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液III 1LTris 12.114g浓浓HCl 3mLEDTA 0.584g 2-硫苏糖醇硫苏糖醇DTT 1.54 g 以下为每升溶液配方以下为每升溶液配方3、破菌及包涵体的变性、破菌及包涵体的变性实验内容实验内容菌体的破碎菌体的破碎

7、包涵体的分别包涵体的分别包涵体的洗涤包涵体的洗涤规范曲线的绘制规范曲线的绘制实验操作：实验操作：1悬浮菌体：离心搜集的菌体，用悬浮菌体：离心搜集的菌体，用50毫升毫升PBSpH 7.4悬浮菌体。悬浮菌体。2超声破碎：冰浴条件下超声波裂解细菌，超声破碎：冰浴条件下超声波裂解细菌，功率功率400W，5s/5s,直至溶液变为半透明。直至溶液变为半透明。3搜集包涵体沉淀：搜集包涵体沉淀：10000rpm离心离心20min，弃上清，搜集包涵体沉淀。，弃上清，搜集包涵体沉淀。4 4包涵体的洗涤包涵体的洗涤沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液I I，充分混匀。，充分混匀。44，10000rp

8、m10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液II II，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液IIIIII，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。4、包涵体变性及复性包涵体的变性测变性液蛋白含量复性配制亲和层析缓冲液配制1 1变性变性 将包涵体沉淀按将包涵体沉淀按5%5%V/VV/V的稀释度用变性液悬的稀释度

9、用变性液悬浮，室温静置浮，室温静置3030分钟，分钟，10000rpm10000rpm离心离心30min30min，留，留上清。上清。2 2用紫外吸收法测变性液蛋白含量用紫外吸收法测变性液蛋白含量 利用规范曲线，根据测出的未知样品的利用规范曲线，根据测出的未知样品的A280A280值，值，即可查出未知样品的蛋白质含量。即可查出未知样品的蛋白质含量。 3 3复性复性将溶解后的蛋白质将溶解后的蛋白质150 ug/ml150 ug/ml稀释稀释100100200ug/ml200ug/ml，以，以PBSPBS低温透析，换透析液低温透析，换透析液一次，透析过夜。一次，透析过夜。洗脱缓冲液洗脱缓冲液B B

10、 NaH2PO4 6.00g NaH2PO4 6.00g NaCL 1.755g NaCL 1.755g 咪唑咪唑 27.23 g27.23 g 用高浓度用高浓度NaOHNaOH调调pHpH至至8.08.0。4配制亲和层析缓冲液配制以下为每升配方配制亲和层析缓冲液配制以下为每升配方平衡缓冲液平衡缓冲液A Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.245 g NaCL 8.19g KCL 0.201 g 用高浓度用高浓度NaOH调调pH至至8.0。介质洗涤液介质洗涤液0.5M NaOH5 5、亲和层析及样品检测、亲和层析及样品检测亲和层析亲和层析用紫外分光光度计初步检测样品用紫外分光光度计初步检测样品亲和层析操作亲和层析操作1样品处置样品处置 透析液透析液pH用高浓度用高浓度NaOH调调pH至至8.0待待上样。上样。2上样上样 将样品以滴管沿壁悄然加到平衡好的将样品以滴管沿壁悄然加到平衡好的Ni-IDA上。上。3洗涤杂蛋白洗涤杂蛋白 以平衡缓冲液洗以平衡缓冲液洗5个柱体积。个柱体积。4洗脱洗脱 以咪唑洗脱液洗洗以咪唑洗脱液洗洗5个柱体积并搜集洗脱个柱体积并搜集洗脱液液 5介质清洗用10倍体积0.5M NaOH过柱，保证介质与NaOH溶液接