AgilentHPLC仪器组成及基本操作步骤

1、Agilent1200HPLC仪器组成及基本操作步骤Agilent1200HPLC结构图真空脱气机：仁手动进样器4、柱温箱（色i普柱:固定相2.输液系统（四元泵）1.溶剂（流动相）一5.检测器高效液相色谱法（HPLC：是在经典液相色谱法的基础上，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。它具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广的特点。一. 溶剂瓶装置溶剂使用棕色玻璃瓶会避免藻类的生长；所用的水为重蒸水；溶剂选用色谱纯，使用前要用0.22卩m的过滤膜过滤；使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液，建议不超过两天；避免

2、溶剂瓶暴露在直射阳光下。避免使用下述可腐蚀钢铁的溶剂：碱金属卤化物及其酸溶液（如：碘化锂、氯化钾等）；高浓度无机酸，如硝酸、硫酸；可能含有过氧化物的色谱醇醚（如THF二氧六环、二丙基乙醚）。这些在使用前必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物；含强络合剂的溶液（如EDTA乙二胺四乙酸）；四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液。二. 在线脱气装置瓶头部件(G1311-60003)沼刑瓶箱输出管子央(G1322-S73iXJ)洁诜阀廉潢管(5062-2461)输出毛细管至自动谴样器(G1312-67306)MCCV漩绒麽漏管的接头【50鸵2如6再订购包装，5m)在线脱气机工作原理3M（只赫匹个制通道中的一

3、个）真空箱四元泵真空脱气机由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个真空泵构成。打开真空脱气机的电源开关后，控制电路即开启真空泵，真空泵运行使真空箱内产生部分真空。真空度由压力传感测定，根据传感器信号，真空脱气机通过运行或关闭真空泵来维持真空度。溶剂瓶中的溶剂在LC泵的抽动下流过真空箱内的特殊管状塑料膜。当溶剂经过真空管时，溶剂中溶解的气体将渗透过塑料膜进入真空箱，到达真空脱气机出口时，溶剂几乎被完全脱气而不含有任何气体。三. Agilent1200四元泵5四蹶縣统打啲23"55当盐溶液和有机溶剂混合时，盐溶液可能与有机溶剂完全混溶，而不会出现沉淀。但是在梯度阀的混合点，重力作用使

4、盐颗粒沉淀下来。通常，阀的A通道用于水相/盐溶液，而泵的B通道用于有机溶剂。如果使用的是这样的配置，盐将落回到盐溶液中，并被溶解。A:水相B:甲醇C:乙腈D:缓冲盐当泵头安装有冲洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要打开seal-wash,用10%异丙醇冲洗泵。10%异丙醇有助于降低水的表面张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。四. 手动进样器先使阀处于装样(load)位置，用微量注射器将试样注入贮样管(samplingloop)。进样时，转动阀芯至进样(injection)位置，贮样管内的试样由流动相带入色谱柱。定量环为20卩l。五. 检测器按其

5、适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外检测器和荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质，如示差折光和蒸发光散射检测器。紫外检测器的工作原理是朗伯-比尔定律。紫外检测器包括固定波长、可变波长和光电二极管阵列检测器。可变波长紫外检测器一般采用氘灯为光源，能够按需要选择组分的最大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。基本操作步骤实验前准备 明确实验目的和检测样品的性质，选择相应的分析色谱柱； 配制分析的样品和流动相，选用色谱纯流动相或用0.22卩m的过滤膜过滤(进口甲醇和乙腈不用过滤)； 检验仪器和

6、计算机的电源线，数据线是否连接完好。开机 将所用的通路小心放入试剂瓶中（防止滤头破裂），色谱柱按流速的方向装好，要拧紧并在柱头和柱尾的下面垫上滤纸； 先打开总电源的开关，然后打开计算机的电源，待计算机运行稳定； 从上到下依次打开脱气机、泵、柱温箱、检测器的电源开关； 待仪器自检完成后，双击桌面上的“联机”图标，打开工作站（如图一所示）设定参数 更改样品信息：单击运行控制下的样品信息弹出对话框（如图二所示），更改操作者姓名、子目录和所存储的文件的文件名。 设置试剂瓶的填充量：单击界面上的试剂瓶的图标，设定溶剂的体积（如图三所示） 启动各个模块：点击启动泵、柱温箱的快捷键，启动泵和柱温箱，等柱压稳

7、定后才能启动检测器。 设置柱温箱：在图标上点击鼠标右键，单击设置柱温箱出现对话框（如图四所示）然后设置实验所需要的柱温。 脱气：单击泵的图标，点击设置泵，弹出对话框（如图五所示）先将阀旋开12圈，设置流速为5ml/min,含量为100%依次purge各个管路，一般先purge水相再purge有机相。每个管路purge35分钟，purge时一定要认真检查滤头和管路中是否残留有气泡。Purge完后，将流速设为1ml/min，并迅速将阀拧紧，用100%甲醇或乙腈冲洗柱子，待柱压稳定后可以打开检测器。 单击检测器的图标，然后单击设置VWD信号可出现对话框（如图六所示），可以设置所用的波长。注意：若流动

8、相里有缓冲盐就先用100%甲醇或乙腈冲洗柱子半个小时然后还要用95%水和5%纯甲醇或纯乙腈冲洗柱子最少15分钟，然后再用你所需要的流动相比例走基线。基线稳定后就可以进样分析。在对话框中可以设置梯度洗脱（如图八所示）数据分析：双击桌面上的脱机图标，出现对话框然后单击文件夹图标（如图九所示）关机 样品分析完后，用100%甲醇或乙腈冲洗柱子最少半个小时。如果流动相里有缓冲盐要先用95%水和5%纯甲醇或乙腈冲柱子半个小时，然后再用100%甲醇或乙腈冲洗柱子半个小时。 冲洗完后，将流速设为Oml/min，将水相中的滤头放入有机相中，将阀打开，设流速设为5ml/min，含量为100%，purge水相的管路

9、。若用的有缓冲盐，要先将滤头放入纯水中purge35分钟，然后再放入有机相中purge35分钟。各个管路purge完后，将阀拧紧。 依次关闭界面上的泵、柱温箱和检测器。关闭联机和脱机的界面，然后关闭计算机。 从下到上依次关闭仪器的各个模块的电源开关，然后换下色谱柱。 关闭总电源。注意事项： 配制流动相所用的水要为重蒸水，新鲜配制，使用前要用0.22卩m的过滤膜过滤。要用色谱级的有机试剂。 有机系和水系的滤膜要分开，有机系的滤膜也可以过滤水系，但是水系的滤膜不能过滤有机系，有机相会腐蚀滤膜。 供试品一定要用0.45卩m的滤头过滤，否则会引起进样阀阻塞。 泵启动前要开启seal-wash，用10%

10、异丙醇冲洗泵。设流速为一分钟三滴，若流动相中含有缓冲盐，设流速为三秒钟一滴。 流动相使用前要进行脱气，脱气前一定要将阀打开12圈，purge时要仔细检查滤头和管路中是否有气泡，脱气完后将流速设为1ml/min后，迅速将阀拧紧（不要拧的过紧）。注意观察压力，若压力大于10bar，要与管理员联系。 一定要将柱头和柱尾拧紧，防止漏液。如果漏液，将流速设为0ml/min，然后再将柱子装好。用100卿醇或乙腈冲洗柱子时，注意观察柱压如果柱压过大，要将流速设为0ml/min，然后检查原因，防止将脏东西流入检测器。 为保护检测器，等柱压稳定后再开启检测器。 进样品前要修改样品信息，否则会将上一个样品的信息覆

11、盖。 进样前后都要用甲醇清洗进样针和进样阀。 样品分析完后，为保护滤头，要将水相中的管路放入有机相中purge35分钟。为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1m