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1、一 肿瘤相关基因1、从分子生物学的角度，恶性肿瘤可视为基因的疾病。某些染色体上的损伤致使基因突变的结果，导致细胞的过度生长、缺乏分化而异常增生，并可侵犯正常组织和器官，最终可以扩散到全身。肿瘤的发生多因素,多基因,多阶段,多途径。2、直接致癌物指直接暴露于细胞和机体便可致癌的因素或分子。3、前致癌物指需经代谢转化方具有致癌活性因素或分子4、癌基因：是指细胞内或病毒内存在的能促进细胞生长和分化的基因它的结构异常或表达异常可引起细胞癌变。细胞癌基因激活的方式（点突变、基因易位、基因扩增、启动子的插入、去甲基化）5、恶性肿瘤中则是糖酵解抑制有氧氧化，Warburg称为效应。肿瘤无论在有氧、无氧的条件

2、下均表现为糖酵解活跃，因此与之相关的酶活性均增强。6、肿瘤细胞膜发生的改变：细胞膜通透性增强是肿瘤的特征；植物凝集素引起的凝集性增加使肿瘤细胞表现接触抑制；细胞膜粘附性降低有利于癌的侵袭和转移；膜表面负电荷增加；糖蛋白中的糖链改变是肿瘤常见的变化；膜糖脂组成发生变化；恶性转化细胞膜上存在肿瘤纤溶酶。7、肿瘤侵袭和转移的三个过程：肿瘤细胞与细胞外基质的粘附、结合。肿瘤细胞外基质的蛋白水解酶的降解。肿瘤细胞转移至被水解的基质区进一步生长、扩散。二基因诊断与基因治疗1、基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也

3、可以是蛋白质或者多肽。2、southern blotting：即将待测DNA酶切、电泳、转移（印）并固定在固相支持物上，用已知DNA探针进行检测的方法。提取DNA限制性内切酶消化DNA,以产生特定长度的片段凝胶电泳分离变性处理DNA转印到膜上并使其牢固结合将标记的探针与膜上DNA片段杂交分析杂交信号。4、northern blotting：RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的RNA分子的含量与大小。14)Southernblot：DNA印迹杂交，指利用具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子

4、的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱，此即DNA印迹杂交。Northernblot：RNA印迹杂交，首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。Westernblot：蛋白质印迹。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。5、原位杂交：是指将特定标记的已知顺序核酸探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本

5、或组织标本上进行。6、荧光原位杂交：是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名；基本原理用荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。7、聚合酶链式反应（PCR）: 是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA的短时间内大幅增加。8、反转录病毒前病毒的结构特点：两端各有一长末端重复序列LTR，LTR由U3、R和U5三部分组成,U3在内有增强子和启动子,U3和U5两端分别有病毒整合序列

6、,在R内还有ployA加尾信号。病毒具有3个结构基因，9、广义的基因治疗：外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。三、分子生物学技术1、核酸分子杂交技术：是在DNA变性和复性的基础上建立起来的一种分子生物学技术. 其原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链(碱基对之间非共价健形成稳定的双链).2、核酸探针：是指用放

7、射性核素、生物素或其他活性物质标记而便于检测的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。3、人工合成的寡核酸探针有下述优点：短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。可以在短时间内大量制备。在合成中进行标记制成探针。可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配4、筛选寡核苷酸针的原则：长1850bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。碱基成分：G+C含量为40%60%，超出此范围则会增加非特异杂交。探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发

8、夹”状结构。避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源。5、western blotting的原理：Western Blot被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水

9、平的表达。四、电泳1、电泳：是指带电粒子在电场中向与自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。2、电泳分离技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。3、电渗：液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。4、不连续凝胶电泳：是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径的电泳方式，可提高分辨率、有浓缩效应。5、 影响电泳的主要因素有哪些？颗粒自身结构因素，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。外界因素：电场强度 ，溶液的pH值，溶液的离子强度，电渗现象，温度的影响，支持物的影响（介质粘度）6、 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？聚丙烯酰胺凝胶是

10、由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。7、 不连续电泳样品压缩成层原理。缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，

11、蛋白质夹在中间而被压缩。凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。8、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS和巯基乙醇后:巯基乙醇使蛋白质二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白质的分子量。9、 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何测定蛋白质等电点？SDS-聚丙烯酰凝胶电泳和等电点聚焦电泳（电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电解质载体即形成：由阳极到阴极连续增高的pH

12、梯度。 Proteins进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上而停止，从而使不同等电点的P得以分离。）五PCR1、 聚合酶链反应(PCR) 又称体外核酸扩增技术，将目的基因或某一DNA片段于体外快速扩增至百万倍,千万倍。特点：简便、特异、快速、灵敏、产率高、 重复性好、易自动化等2、 PCR技术的基本原理：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1): 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右后，双链DNA变性为单链DNA ；2): 模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3): 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqD

13、NA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需14分钟， 23小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。3、设计引物应遵循以下原则：1): 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。2): PCR产物： 200-500bp，可扩增长至30kb的片段。3): 引物碱基：G+C含量以40-60%，G+C太少扩增效果不佳， G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免4个单一碱基的连续出现。4

14、): 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体。 5): 引物3端的碱基应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6): 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性. 7): 引物5端加上合适的酶切位点，这对被扩增的靶序列的酶切分析或分子克隆很有好处。在算Tm值时不算, 但在检测互补和二级结构是要加上它们 8): 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) 9): 最好学会使用一种design software. PP5, Oligo6, DN

15、Astar, Vector NTI, Online desgin et al.4、实时荧光定量PCR原理：指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。5、Ct阈限循环值：每个反应管内的荧光信号强度到达设定的检测域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。6、荧光探针：探针退火温度应比引物高510，一般情况下探针长度小于30bp，5末端不能是G，G可能会淬灭荧光，选择GC含量在3080的目标序列设探针，将探针置于G和C含量高的区域，引物尽量靠近探针，先合成引物

16、，用SYBR Green I进行筛选，确定引物特性后再合成探针。7、 理想的 real-time PCR体系应该具备的特点: PCR扩增产物特异性高， 理想的PCR效率（90105），理想的重复性， 较宽的动态范围（9个数量级）灵敏度每个特性都可以通过优化取得，并通过实验来验证端粒酶的工作原理答：原核生物的染色体是环状的，其5最末端岗崎片段的RNA引物被降解后可借助另半圈DNA链向前延伸来填补。但真核生物线性DNA在复制后，不能填补5末端的空缺，从而会使5末端序列因此而缩短。真核生物通过形成端粒结构来解决此问题，复制使端粒5末端缩短，而端粒酶可外加重复单位到5末端上，结果便是维持端粒一定的长度

17、。端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它以所含的RNA引物为模板来合成DNA端粒结构。端粒酶可结合到端粒的3末端上，RNA引物的5末端识别DNA的3末端碱基并相互配对，以RNA链为模板使DNA链延伸，合成一个重复单位（TTTAGGG）后，酶再向前移动一个单位。合成结束后，端粒的3单链末端折回作为引物，合成其互补链。六、蛋白质1、肽键：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的，羧基脱水缩合所形成的键 2、肽：氨基酸通过肽键相连形成的化合物 3、肽链：指多个氨基酸以肽键相连形成的一条长链。4、氨基酸残基：构成肽链的一个个氨基酸单位因为参与肽键的形成已不再是原来完整的分子。5、主链与侧链（backbone

18、and side chain）：多肽链中肽键与-碳原子形成一条骨架，称为主链；氨基酸的侧链R基团在此骨架上向外延伸，形成肽链的侧链。6、蛋白质一级结构 指多肽链中氨基酸的排列顺序，稳定因素：肽键7、构象(conformation)：指构成分子的原子和基团因为化学键的旋转而形成在三维空间上不同的排布、走向。构象的改变不涉及共价键的破裂，仅涉及氢键、疏水键等次级键的变化。 8、蛋白质二级结构定义：指多肽链主链骨架的局部肽段上形成的有规则或无规则的构象,并不涉及氨基酸残基侧链的构象。 稳定因素：氢键，基本类型：-螺旋和-折叠（有规则）-转角和环（部分有规则）无序结构9、肽平面：由于肽键带有部分双键的

19、性质，不能自由旋转，这样促使构成肽键的C、H、O、N四个原子和与之相连的两个C都处于同一个平面，这个平面即肽平面。 10、 二面角：单键的旋转角度，二面角决定了两个相邻肽平面的空间相对位置 11、 蛋白质的三级结构：指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链的所有原子在三维空间的排布位置。 稳定因素：侧链R基团之间相互作用形成的各种非共价键，包括疏水键、氢键、离子键和范德华力等，如肌红蛋白。12、 蛋白质的四级结构：由两条或两条以上的具有蛋白质三级结构的蛋白质亚基通过非共价键结合，形成亚基间特定空间排布及相互作用的多聚体。稳定因素：主要靠氢键和离子键，举例：血红蛋白（hemogl

20、obin,Hb）13、别构效应：指蛋白质与配基结合后能改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。血红蛋白是至今了解得最清楚的一个别构蛋白质，有两种能够互变的构象，紧密型T和松弛型R。别构效应的机理：正协同效应：当第一个亚基与配体结合后，可促进下一个亚基与配体的结合，称为正协同效应。 14、蛋白质超二级结构：相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体，又称基序，如，15、蛋白质的结构域: 分子量大的蛋白质三级结构常可分割成1个和数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域，如平行/型 反平行-型 全-型 小的不规则结构 16、导肽（leader sequence）的性

21、质：富含带正电荷的碱性氨基酸，引导肽中缺少或不含带负电荷的酸性氨基酸，带羟基的氨基酸如Ser和Thr在引导肽中的含量也比较丰富，可形成一种带正电的两性-螺旋结构，一侧是带正电的亲水表面，另一侧为疏水性表面。17、导肽运输途径的具体过程：前体蛋白首先与外膜表面受体结合，然后转移至TOM 复合物；前体蛋白以去折叠状态并以N 端先通过的方式穿过TOM 复合物的跨膜通道；在TIM复合物的协同作用下，出现在膜间隙侧的前体蛋白被牵引至TIM复合物表面；在线粒体内膜膜电位和mtHsp70 水解ATP 提供的能量驱动下，前体蛋白穿过TIM跨膜通道，最终被mtHsp70 牵引进线粒体基质。在基质中，前体蛋白被线

22、粒体加工肽酶水解剪切掉前导肽后折叠形成成熟的蛋白。18、分子伴侣(chaperone),是细胞内 的一类保守蛋白质 ，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠; 从功能上定义的，凡具有 辅助蛋白折叠功能的蛋白都是分子伴侣，它们的结构可以完全不同。19、分子伴侣作用：通过催化的或非催化的方式，加速或减缓蛋白质组装过程；传递蛋白质组装所需要的空间信息；抑制组装过程中不正确的副反应；帮助正确的 “非共价组装”，排除共价修饰酶；不仅帮助新生肽链的折叠，还帮助新生肽链成熟为活性蛋白质，包括转运、跨膜定位、亚基组装等。20、分子伴侣的作用特点：参与催化、介导其他多肽链或寡聚体蛋白质分子的

23、折叠与组装，但不是蛋白质最终结构的一部分;与靶蛋白的结合不具高度专一性，同一伴侣分子可促进多种氨基酸序列不同的多肽链折叠;只是分子折叠的协助者，本身并不含正确折叠所必须的构象信息，而是通过阻止非天然多肽内部或相互间的不正确作用而发挥效能。热休克蛋白21、脂蛋白：血脂与蛋白质的结合，由蛋白质、甘油三酯、磷脂、胆固醇及其脂组成22、分泌蛋白：是指在细胞内合成后，分泌到细胞外起作用的的蛋白质，在核糖体上合成的分泌蛋白，要经过内质网和高尔基体，而不是直接运输到细胞膜。信号肽是存在于所有分泌性蛋白一级结构N端的共同序列，与多肽链的识别转运入内质网密切相关。七、DNA序列的测定1、双脱氧链终止法：在一般D

24、NA复制中加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。原理是采用核苷酸链终止剂2，3，-双脱氧核苷酸终止DNA的延长。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。

25、方法是分成四组分别为ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA序列。2、DNA芯片技术：是指通过微加工技术将大量的DNA以预先设计的排列方式有序地固定在载体表面，形成储存有大量信息的DNA阵列。该阵列与标记的核酸杂交后，能在短时间快速，准确地获取大量信息。 DNA芯片制作方式： 1): 在固相支持物上直接合成探针 2): 在固定面上固定已合成的探针 杂交信号的检测:常用: 荧光信号，放射性标记技术。检测器及处理器由激光共聚焦显微镜及电脑组成，经电脑应用特定软件处理可得出DNA的序列及其变化情况。3、 DNA芯片技术基础: 需要大量已知准确的DNA

26、、cDNA片断信息，高密度芯片制作的精密机械系统和操作工艺，杂交的微弱信号的检出装置，对杂交信号及相关信息、数据的大规模收集, 和分析的能力。特点：高通量、大规模、平型性等4、 DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA 。 5、 基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称

27、重组DNA工艺学。目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）6、 基因载体：能携带目的基因，具有自我复制能力，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质的一些DNA分子。质粒DNA,噬菌体DNA，病毒DNA。7、 载体的选择：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。8、 重组DNA的技术基本原理：目的基因的获取，克隆载体的选择和构建，外源基因与载体的连接，DNA导入受体细胞，重组体的筛选，克隆基因的表达 。9、基因敲除：利用DNA体外重组技术

28、构建基因敲除的打靶载体，然后根据同源重组的原理将打靶载体导入受体细胞中，使特定基因活性丧失。10、基因沉默技术的目的是对具有特定序列的基因表达进行特异的抑制。11、RNA干扰(RNAi) ，当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（dsRNA)时，诱导该同源mRNA发生降解而导致该基因表达沉默的现象。此过程发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默12、RNAi 的作用特点：“共抑制”: RNAi 使外源基因同源的内源基因沉默；效率高: 效率比单纯反义或正义RNA 的抑制效率高100fold, 使靶基因表达降到很低水平甚至完全“剔除” (knockdown) 。它比基因敲除技术(knoc

29、kout)更为便捷。特异高: RNAi能特异性降解mRNA单个碱基的改变即可使RNAi失效。穿透能力强: RNAi能在不同的细胞间长距离传递。稳定性高:此机制可能是siRNA与某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性; RNAi具有一定的可遗传性。13、RNAi 的作用机制1): 在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶(RNase) -Dicer 在ATP的参与下被处理为21个23个碱基的小RNA，即小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA是由19个21个碱基配对形成的双链, 并在其3末端有两个游离未配对的核苷酸。siRNA 是RNAi 作用发

30、生的重要中间分子；双链的两端各有23个突出的非配对的3碱基；两条单链末端为5端磷酸和3端羟基。这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础。2): siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在siRNA中反义链互补结合的两端切割mRNA。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA

31、不仅能引导RISC切割同源单链mRNA， 可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。八、基因组学1、基因组学：指在遗传学研究进入分子水平后发展起来的学科，主要研究生物体全基因组的分子特征。1、 遗传图谱：利用人类基因组的一些特殊位点作为遗传标记进行基因组分区，即通过计算遗传标记的重组率，以重组率的大小反应遗传标记间的相对距离绘制遗传图谱。标记包括：限制性片段长度多型性，简单序列长

32、度多态性，单核甘酸多态性。2、 物理图谱：利用已知序列的DNA片段为基因组分区，标记有限制性内切酶的酶切位点，基因，序列标签位点。3、 转录图谱：是指转录体或其反转录而成的cDNA在基因组中的位置，又称基因图谱或表达图谱，根据组织细胞中可表达片段标签绘制的图谱，是将mRNA逆转录合成的cDNA或EST的部分cDNA片段作为探针与基因组DNA进行分子杂交，标记转录基因，绘制出可表达基因的转录图。4、 序列图谱：是人类基因组的全部核苷酸的排列顺序，是将人类基因组DNA分段克隆，然后组件进行序列分析，在按标志将各重叠片段拼接，构成完整的基因组DNA序列图。5、 一代测序：DNA链末端合成终止法，6、

33、 二代测序：新一代的测序技术、深度测序、高通量测序技术，一次可完成数数万到百万条的DNA分子的序列测定，原理是合成法测序、连接法测序，不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，不需要凝胶分离。7、 三代测序：单分子荧光测序，dNTP用四种荧光标记，显微镜下实时记录荧光的变化。当荧光标记的dNTP掺入DNA链的时候，荧光就能检测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的dNTP不会影响DNA聚合酶的活性，在荧光被切除后，合成的链和天然的链完全一致。纳米孔测序，是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序，由于纳米孔的直径非常小，仅允

34、许单个核酸聚合酶通过，而ATCG单个碱基的带点性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。8、 第三代测序技术特点：速度快，一秒可以测10个碱基，精度高，体现了DNA聚合酶自身的特点，可直接测量RNA的序列，直接测甲基化的DNA的序列。九、蛋白组学1、蛋白质组学：大规模水平上研究蛋白的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白的相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于生理、病理等过程的整体而全面的认识。它采用大规模、高通量、高灵敏度的技术手段，通过全局性研究基因组所表达的所有蛋白质在不同时间与空间的表达谱和功能谱，全景式地揭示生命活动的本质。2、主要技术路线：样

35、品的选择和处理：尽可能采用简单的方法处理，以免蛋白质的丢失；细胞和组织样品的制备尽可能减少蛋白质的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解；样品裂解液应该新鲜制备，已制备好的样品不要反复冻溶，加入尿素后加温小于37，因为加热后尿素分解产生的可对蛋白质产生氨基酸甲酰化修饰，氰酸盐引起电荷改变。蛋白质的分离：免疫亲和细胞分离技术，利用单克隆抗体特异性结合细胞表面抗原的亲和细胞分离技术；激光捕获显微切割技术，是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜乙烯乙酸乙烯酯膜（其最大吸收峰接近红外激光波长）