DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用-

1、D NA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用董慧明1,2,张颖23,张德民1,向光明2,李慧2(1.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连116029;2.中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳110016摘要土壤中的微生物多样性是十分丰富的,传统培养方法对土壤微生物多样性的研究有很大局限性。近年来,各种基于16S rDNA基因的指纹图谱分析技术取得了长足的进步,并广泛应用于土壤微生物多样性的研究。这些技术主要有变性梯度凝胶电泳(D GGE/温度梯度凝胶电泳(T GGE、单链构象多态性(SSCP、随机引物扩增多态性DNA(RA PD、限制性片段长度多态性(RFL P和扩增核糖体DNA限制性分

2、析(ARDRA等。对这些技术近年来在土壤微生物多样性研究领域的应用予以简短综述,并初步探讨未来几年土壤微生物分子生态学发展的方向。关键词土壤微生物多样性;16S rDNA;指纹图谱分析;分子生态学中图分类号S154.3文献标识码A文章编号1005-7021(200701-0045-05Application of Fingerprint Atlas Analysis B ased on16S rD NA G ene in Soil Microbial DiversityDON G Hui2ming1,2,ZHAN G Y ing2,ZHAN G De2min1,XIAN G Guang2min

3、g2,L I Hui2(1.Coll.of L i f e S ci.L i aoning N ormal Univ.Dalian116029;2.I nst.of A p pl.Ecol.Chn.A cad.of S ci.S heny ang110016AbstractThe diversity of microorganisms in soil is very abundant,however,the traditional methods to study the diversity of soil microbes were restricted greatly.Recently,f

4、ingerprints atlas analysis technologies based on 16S rDNA genes have made rapid progress,and have widely applied in the study of soil microbial diversity. They are mainly denaturing gradient gel electrophoresis(D GGE,temperature gradient gel electrophoresis (T GGE,single2strand conformation polymorp

5、hism(SSCP,randomly amplified polymorphic DNA(RA PD, terminal restriction f ragment length polymorphism(T2REL P,amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRAetc.Recent applications of these technologies in the study of soil microbial diversity were briefly summarized in this paper,and primarily

6、 investigate the direction of the development of soil microbiological mo2 lecular ecology in the near f uture.K eyw ordssoil microbial diversity;16S rDNA;fingerprints atlas analysis;molecular ecology微生物是土壤生态系统中重要的组成部分。土壤中的微生物在生物圈中的生命元素(N、P等和许多痕量元素(Fe、Ni等的生物地球化学循环中发挥着至关重要的作用,它们参与土壤中能量和营养交换,对维持生态系统的平衡

7、起着不可替代的作用。同时土壤微生物在土壤形成、发育、土壤肥力保持及高等植物生长方面也起着重要作用。土壤微生物是陆地生态系统中重要的生命体,其群落结构组成及其变化在一定程度上反映了土壤的质量及其健全性,因此对土壤微生物多样性研究具有重要意义1。1土壤微生物学多样性研究现状依赖于显微镜技术和纯培养技术的传统微收稿日期:2006-10-27作者简介:董慧明女,硕士研究生。现从事应用与环境微生物方面的研究。基金项目:国家自然科学基金项目(30670391;国家重点基础研究发展计划项目(2004CB4185053通讯作者54微生物学杂志2007年1月第27卷第1期J OURNAL OF MICROBIO

8、LO GY J an.2007Vol.27No.1生物学研究方法对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性,据估计土壤中约有99%的微生物还不能在实验室被成功地培养出来2。20世纪中后期随着土壤微生物多样性研究向多方面发展,人们也尝试利用分析微生物细胞中某种指示成分(如磷脂脂肪酸PL FA来研究土壤微生物的种群组成,但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性,并且如果某种微生物的PL FA是未知的,则该不可培养微生物仍难以鉴别3,4。1980年,Torsvik教授首次建立了从土壤样品中直接提取细菌DNA的方法,并于1990年用DNA杂交技术研究发现,1g土壤中有4000

9、个以上不同的细菌种类,说明土壤中微生物多样性是极其丰富的5。16S rDNA在原核微生物中普遍存在,并且含有相对保守区域和可变区域,大小也适合电泳技术分析,目前主要应用16S rDNA 序列分析来研究原核微生物群落多样性,通过与已建立的微生物16S rDNA序列数据库比较,可以确定特定微生物的系统发育关系6。1986年, Pace等第一次以16S rDNA确定环境样品中的微生物后,使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识,此后,基于16S rDNA基因的指纹图谱分析的分子生物学技术得到迅速发展2。这些技术克服了传统培养技术的限制,提供了一种分析整个微生物群落的方法,更为精确地揭示土壤中微生

10、物种群结构及其动态变化。因此,基于16S rDNA基因的指纹图谱分析技术近年来被国内外诸多学者广泛应用于土壤微生物多样性的研究中。其总的技术路线:分离微生物基因组DNA,用特异性引物扩增16S rRNA基因片段,再将该PCR扩增产物进行更深一步分析,从而可在种、属的水平上研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化7。2基于16S rDNA基因的指纹图谱分析技术2.1变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳1993年,Muyzer等将变性梯度凝胶电泳(denat uring gradient gel elect rop horesis,D GGE技术引入环境微生物学多样性的研究8。随后,该技术被广泛用

11、于比较不同生态系统中的微生物群落的多样性及监测特定微生物种群的动态变化。D GGE和T GGE(temperat ure gradient gel elect rop horesis的原理是根据含有不同序列的DNA片段(16S rRNA基因扩增产物在具有变性剂梯度或温度梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的不同,部分解链的DNA片段在凝胶中的迁移速率低于完全螺旋形式的DNA分子,从而含有不同碱基序列的DNA片段就得到有效分离。结合PCR扩增标记基因或其转录物(rRNA和mRNA的D GGE方法能直接显示微生物群落中优势组成成分。由于它可同时对多个样品进行分析,使之非常适合研究微生物群落

12、的时空变化,而且可以通过对切下条带进行序列分析或通过与独特的探针杂交鉴定群落组成,可以方便地了解环境被干扰后的微生物群落变化或某种指示微生物的命运9。J acek和J an 利用D GGE方法分析了不同污染程度土壤细菌的群落结构,结果表明,在微生物群落结构上显示出了极大的差异性10。Oliver等用D GGE方法考察了农田微生物的变化情况,认为环境变化对农田微生物的多样性有很大影响11。但是, D GGE/T GGE技术也存在一定的局限性。其缺陷之一是只能分离约500bp大小的DNA片段,这限制了作为下一步用于杂交分析的探针设计。并且,研究报道有些种类细菌16S rDNA在D GGE上不只显示

13、1条带12,而不同种细菌的16S rDNA序列在D GGE上也可能因为具有相同的解链行为而不能被分开13。即便存在以上的一些局限性,D GGE/T GGE仍是分析微生物群落多样性较为敏感的方法之一。2.2单链构象多态性单链构象多态性(single2st rand conformation polymorp hism,SSCP是对16S rRNA基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方法。该技术最初用来检测人类DNA的基因多态性,Lee等在1996年首次报道将SSCP技术应用到环境样品微生物群体多样性分析14。不同碱基序列的单链DNA分子构象不同,DNA片段变性成单链后受到凝胶不同分子筛作用力最

14、终使不同DNA片段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序,或采用特异性探针进行杂交,进而显示该特定微生物类群的动态变化。Holly等利用SS264微生物学杂志27卷CP技术研究发现在植物根际土壤中大量存在古菌Crenarchaeot,该类微生物以往一直被认为只存在于极端嗜热环境当中15。Sabine等通过SSCP技术考察了不同盐度(020%土壤中微生物菌群的变化,研究发现在高盐度土壤中R al2 stoni a spp.和一些杆菌,包括H alomonas、Dietz i a 和A lcani vorax为优势菌,而在低盐度土壤中S p hi ngomonas spp.为主要优势菌16

15、。但是,SS2 CP技术重现性较差,易受胶浓度和电泳温度等条件的影响,另外SSCP能够有效分离的DNA序列过短(150400bp。2.3随机引物扩增多态性D NA由Williams建立的RA PD(Randomly am2 plified polymorp hic DNA技术,因具有操作简便、快速和经济等优点而得到了广泛应用17。该技术以随机寡核苷酸(510nt做为引物,扩增得到的多态性片段较短,更方便检测两个同源或异源等位基因的有无,适用于种内和亚种更为细致的分类。张峦等在室内培养条件下,采用RA PD分子标记技术研究了重金属镉和多环芳烃菲复合污染对土壤中微生物群落DNA序列多样性的影响。结

16、果表明,培养15d和30d后,镉2菲单一和复合污染均导致土壤微生物群落DNA 序列的丰度、均度和多样性指数增加18。重复性不好是该技术存在的主要问题,而DNA模板的质量与数量、MgCl2和引物浓度的变化都有可能导致得到不同的图谱。另外,从条带图谱中无法得到任何微生物系统发育信息。2.4限制性片段长度多态性和扩增核糖体D NA 限制性分析RFL P(rest riction fragment lengt h polymor2 p hism方法和A RDRA(Amplified ribo somal DNA restriction analysis方法也常用于微生物群落的分析。通用引物PCR扩增得

17、到16S rDNA片段,被限制酶切割,然后再进行电泳形成不同长度的片断进行分析。其所获得的谱带更为简单,易于分析,不受菌株是否纯培养的限制,不受宿主的干扰,具有特异性强,效率高的特点。广泛应用于新物种的发现、微生物分类及鉴定、共生菌、病原菌的微生物遗传多样性的检测等。Qvreas等利用ARDRA方法考察两种不同农田土壤的微生物群落时,发现两者无显著差异19。张于光等利用RFL P方法对三江源地区不同的植物类型的土壤中固氮微生物群组成进行了研究,发现所有土壤样品中分别具有12个优势微生物种群20。但是该技术所能获得的信息量相对较少,并且难以用来评估物种的丰度和均度。2.5末端限制性片段长度多态性

18、T2RFL P(terminate2restriction lengt h f rag2 ment polymorp hism是RFL P/A RDRA方法的进一步发展,所不同的是在PCR扩增16S rRNA 基因过程中,其中一个引物用荧光标记,在计算机程序自动分析时仅分析荧光标记的末端限制片段,这样使得限制片段长度多态性图谱更为简化并且每个可见的条带都代表一个“核型”或一个分类单元21。这种方法能够得到一个群落的特征指纹图谱,可用于比较不同群落的相似性和由于污染压力造成的群落结构在时间和空间上的改变。Pett等22利用T2RFL P技术考察氧化还原电位对土壤菌群的影响,研究发现经过4d的好氧

19、/厌氧处理与未处理的土壤样品菌群结构相似,而经过持续12h的厌氧或好氧处理的土壤样品得到的分子条带则明显不同,在所有样品的179种条带图谱中只有3种是普遍存在的,同时还发现土著菌群对氧化还原电位的变化具有耐受性。Cat herine等对T2RFL P方法进行了完善,采用多个限制性酶来代替单一限制性酶更有利于排除选择酶的干扰,通过叠加靶基因酶切位点,使待定鉴定种属在数据库中匹配度提高23。为得到较精确的结果,可以在产生图谱的同时,对分析样品创建克隆、测序鉴定,但所需费用较高。3存在的问题及展望目前,以上这些技术在土壤微生物多样性分析中得到了较为广泛的应用。近年来也有部分学者总结了基于16S rD

20、NA序列分析的分子生态学技术用于微生物多样性分析的局限性6,24,25。一方面,16S rDNA可能过于保守,无法把亲缘关系很近的种群区分开来24,16S rRNA基因在基因组中的拷贝数多少也直接关系到PCR扩增的效率高低。另一方面,我们对于很多已经成功培养出来的细菌的系统发生的知识了解得并不全面25。Suzuki等26从水环境样品提取DNA构建了16S rRNA基因文库,同时从该样品中分离741期董慧明等:DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用微生物进行纯培养。他们发现许多纯培养出来的细菌却无法通过16S rRNA基因序列分析的方法检测到。这意味着基于16S rDNA序列分析的分子

21、生态学方法可能低估了样品中的微生物多样性。此外,在基因组DNA的提取过程中可能丢失一部分DNA信息,在PCR扩增过程中由于PCR的放大也可能丢失一部分信息,因此,实验中所提取和扩增的DNA是否能够定量反应整个微生物群落的种群丰度是一个值得讨论的问题。指纹图谱上的条带是代表最丰富的种群,最容易提取DNA的种群,最具活性的种群还是这些种群的集合都是一个悬而未知的问题。但不管怎样,基于16S rDNA序列的DNA指纹图谱分析仍是研究土壤微生物多样性最为有效的分子生态学技术之一。它们在准确评价土壤微生物总的丰度,确定某一物种在群落中的比例和群落多样性评价等方面都存在着不可替代的优势。随着环境的恶化、污

22、染的加剧,许多宝贵的土壤微生物资源正在消失,这就更加激发人类迫切了解、认识微生物物种的紧迫性。尽快确定对于土壤生态系统起核心作用的微生物类群并深入研究它们的功能是一个很重要的科学问题。这可能直接关系到多样性的保护和世界的可持续发展。因此需要不断完善现有的方法,使之更加简便准确,另外同时使用不同的技术手段从不同侧面去分析研究,综合分析应该是科学的选择,可能会得出一个更为准确的结果。目前已有报道,将16S rDNA指纹图谱技术与荧光标记技术和杂交技术相结合来研究微生物群落多样性。另外,在方法学上可以预见杂交自动化分析和平行杂交即将实现27,DNA微阵列(DNA microarray28、稳定同位素

23、探针(Stable2isotope probing,SIP29、宏基因组技术(metagenome30、mRNA杂交分析27等也将会有更大的发展,这些方法与基于16S rDNA指纹图谱分析技术相结合势必在微生物多样性领域研究中发挥重大作用,将为阐明生态和生物进化原理提供新的模式,同时也将为许多新兴学科、交叉学科的发展开辟广阔的前景。参考文献:1Kennydy A C,Smit h K L.Soil microbial diversity and t hesustainability of a cultural soilsJ.Plant and Soil,1995,170:75286.2Pace

24、 N R.A molecular view of microbial diversity and t hebiosphereJ.Science,1997,276:7342740.3Shinpei Y oshitake,Masaki Uchida,Takayuki Nakat subo.Characterization of soil microflora on a successional glacier foreland in t he high Arctic on Ellesmere Island,Nunavut, Canada using phospholipids fatty acid

25、 analysisJ.Polar.Biosci,2006,19:73284.4Philip W Ramseya,Matt hias C Rilliga,Kevin P Ferisb,etal.Choice of met hods for soil microbial community analy2 sis:PL FA maximizes power compared to CL PP and PCR2 based approachesJ.Pedobiologia,2006,50:2752280. 5Torsvik V,G oksoyr J,Daae F L.High diversity in

26、 DNA ofbacteriaJ.App1.Environ.Microbio1,1990,56:7822787.6Ant hony G O/Donnel,Heike E G orres.16S rDNA met hodsin soil microbiologyJ.Environmental Biotechnology, 1999,10:2252229.7J ennifer L K irka,Lee A Beaudettea,Miranda Hart b,et al.Met hods of studying soil microbial diversityJ.Journal of Microbi

27、ological Met hods,2004,58:1692188.8Muyzer G,De Wall E C,Uitterlinden A G.Profiling of com2plex micmbial populations by denaturing gradient gel elec2 trophoresis analysis of polymerase chain reaction2amplified genes coding for16S rRNAJ.App1.Environ.Microbio1, 1993,59:6952700.9Muyzer G.D GGE/T GGE a m

28、et hod for indenting genesfrom natural ecosystemsJ.Curr.Opin.Micmbio1,1999, 2:3172322.10J ack K ozadroj,J an Dirk Van Elsas.Application of polymer2ase chain reaction denat uring gradient gel electrophoresis for comparison of direct and indirect extraction met hods of soil DNA used for microbial comm

29、unity fingerprintingJ.Biol Fertil.Soils,2000,31:3722378.11Oliver Dilly,J aap Bloem,An Vos.Bacterial Diversity in Ag2ricultural Soils during Litter DecompositionJ.App1.En2 viron.Microbio1,2004,70(1:4682474.12Nubel U,Engelen B,Felske A,et al.Sequence heterogenei2ties of genes encoding16S rRNAs in Paen

30、ibacillus polymyxa detected by temperature gradient gel electrophoresisJ.J.Bacteriol,1996,178:563625643.13Vallaeys T,Topp E,Muyzer G,et al.Evaluation of denatu2ring gradient gel electrophoresis in t he detection of16S rD2 NA sequence variation in rhizobia and met hanotrophsJ.FEMS Microbiol.Ecol,1997

31、,24:2792285.14Lee D H,Z o Y G,K im S J.Nonradioactive Met hods to StudyGenetic Profiles of Nat ural Bacterial Communities by PCR2 single strand Conformation PolymorphismJ.App1.Envi2 ron.Microbio1,1996,62:311223120.15Holly M Simon,Courtney E Jahn,L uke T Bergerud,et al.Cultivation of Mesophilic Soil

32、Crenarchaeotes in Enrichment Cultures from Plant Root sJ.App1.Environ.Microbio1,84微生物学杂志27卷2005,72(8:475124760.16Sabine Kleinsteuber ,Volker Riis ,Ingo Fetzer ,et al .Popula 2tion Dynamics wit hin a Microbial Consortium during Growt h on Diesel Fuel in Saline Environment s J .App1.Environ.Microbio1,

33、2006,72(5:353123542.17Williams J G K ,Kubelik A R K ,Livek K ,et al .DNA poly 2morphisms amplified by arbitrary primers and useful gene marker J .Nucleic Acids .Res ,1990,18(10:653126535.18张峦,沈国清,陆贻通,等.镉和菲复合污染对土壤微生物DNA 序列多样性的影响J .科技通报,2005,21(6:7632769.19Qvreas L ,Torsvik V.Microbial Diversity and C

34、ommunityStruct ure in Two Different Agricultural Soil Communities J .Microb.Ecol ,1998,36:3032315.20张于光,王慧敏,李迪强,等.三江源地区不同植被土壤固氮微生物的群落结构研究J .微生物学报,2005,45(3:4202425.21Marsh T L.Terminal restriction fragment lengt h polymor 2phism (T 2RFL P :An emerging met hod for characterizing diversity among homol

35、ogous populations of amplification product sJ .Curr.Opin.Microbial ,1999,2:3232327.22Pett Ridge J ,Firestone M K.Redox Fluctuation StructuresMicrobial Communities in a Wet Tropical Soil J .App1.Environ.Microbio1,2005,71(11:699827007.23Cat herine A Osborne ,Gavin N Rees ,Yaniv Bernstein ,et al .New T

36、hreshold and Confidence Estimates for Terminal Re 2striction Fragment Lengt h Polymorphism Analysis of Com 2plex Bacterial CommunitiesJ .App1.Environ.Microbio1,2006,72(2:127021278.24Aclnes S G ,Anton J ,Rodriguez Valera F.Diversity of freelying and attached bacteria in offshore western Mediterra 2ne

37、an waters as depicted by analysis of genes encoding 16SRNAJ .App1.Environ.Microbio1,1999,65:5142522.25Rondon M R.,G oodman R M.,Handelsman ,J.The eart h bounty :assessing and accessing soil microbial diversityJ .Trends Biotech ,1999,17:4032409.26Suzuki M Y ,G iovannoni S J.Bias caused by template annea 2ling in t