微生物酶资源的开发和利用（上）-

1、合肥学院学报(自然科学版Journal of Hefei University(Natural Sciences微生物酶资源的开发和利用(上潘仁瑞1,2,吴克1,蔡敬民1(1.合肥学院生物与环境工程系,合肥2300222;2.中国科学技术大学生命科学学院,合肥230026摘要:概括介绍了微生物酶资源的开发和应用进展,内容包括世界和我国工业酶制剂生产概况,开发酶制剂新品种的重要性和有利条件,快速开发具有应用价值新酶的途径,微生物酶的应用方式和应用领域以及130余种微生物来源的酶在实际中的应用简况。关键词:微生物;酶工程;工业酶制剂;定向进化中图分类号:Q814.9文献标识码:A文章编号:1673

2、-162X(200501-0007-05近年来,酶工程的研究开发和推广利用已成为生物技术中的重要领域。作为生物技术的一个重要组成部分,它可以广泛应用于工业、医药、农业、环境保护、化学分析、新能源开发以及生命科学理论研究等许多方面。随着酶工程研究的快速进展,与之相对应的酶工程产业的发展也非常迅速,是本世纪最具有发展前途的产业之一。酶工程是研究酶的基础理论、生产和应用的一门学科,它是按人为预先设计的方案进行酶的鉴定、分离纯化,研究其结构和功能的关系、酶源生物的诱变育种、酶分子修饰和酶基因改性、酶基因的克隆和表达以及酶的大量生产和应用的系统工程。其发展必将促进生物技术产业的发展,从而对人类社会的经济

3、生活产生重大影响。自然界中,酶的来源广泛,它可以来自动物、植物和微生物。迄今已发现的酶有5000余种,其中已经利用的有150种左右,工业化生产的酶约60余种,仅占已知酶的1.2%,而大规模生产的只有20多种,主要是利用微生物通过发酵法生产的。这是由于微生物不受季节、气候和地域的限制。微生物繁育速度快、品种繁多、易培养、产量高,并且一般由动植物生产的酶大部分可以由微生物制备,或将动植物的酶基因克隆后,在微生物细胞中表达,故可以在短时间内生产大量酶制剂。所以微生物是生产酶的重要来源,对微生物酶资源的开发和应用也就越来越显得重要。1世界工业酶制剂生产概况酶从生物材料中被分离出来,并作成一种制剂,最早

4、的报道是1833年法国化学家A.Payen和Per oz 在麦芽抽提物的酒精沉淀内发现一种对热不稳定的物质,它具有从不溶性的淀粉颗粒内分离出可溶性的糊精和糖的能力,命名为diastase(具有分离之意,麦芽淀粉酶、淀粉酶制剂,可以认为这是制备酶制剂的萌芽。事实上他们还首创了“酶”的词尾2ase,一直被沿用至今。1874年,丹麦出现凝乳酶的广告,它是从小牛第4胃的胃液和粘膜制备的,应用于制造干酪,这是酶制剂商品化的开始。1894年,日本高峰让吉博士以麸皮培养米曲霉,用水提取后,也用酒精沉淀获得淀粉酶,应用于棉布退浆和作消化剂,以后在美国开设Takam ine制药厂生产高峰(他卡淀粉酶,真正实现了

5、微生物酶制剂的工业化生产。此后的发展比较缓慢,直到1939年才改为使用枯草芽孢杆菌的2淀粉酶。20世纪四五十年代随着抗生素深层发酵和菌种选育技术的进步,带动了微生物酶制剂工业的发展。1941年丹麦成立了以微生物酶制剂的主要产品的Novo2nordisk(诺沃诺德公司;到八九十年代,国际上知名的酶制剂企业有70余家。由于世界市场经济的发展,经过激烈的兼并和改组,迄今在世界酶制剂市场中,丹麦的Nov ozy mes公司(90年代中期由诺沃诺收稿日期:2005-02-25基金项目:安徽省自然科学基金(03043104、01043102、050450304,安徽省科技厅优秀青年科技基金(0404305

6、1,安徽省教育厅自然科学基金(2005KJ192项目资助。作者简介:潘仁瑞(1933-,男,江苏常州人,教授,研究方向:微生物工程、蛋白质工程;吴克(1964-,男,安徽合肥人,教授,研究方向:环境工程、酶工程;蔡敬民(19632,安徽合肥人,教授,合肥学院副院长,研究方向:生物工程、环境工程及酶学。8合肥学院学报(自然科学版第15卷德公司改组而成独占世界市场的40%,先后推出500多种酶制剂产品,销售遍及130多个国家和地区;美国Genencor国际公司则占20%,从而使该两大公司具有了强大的竞争力。企业的兼并同时促进了人才的流动,技术的重组和优化,大大缩短新产品的开发周期,扩大了酶的数量及

7、应用领域。微生物酶制剂的世界市场规模在1978年还不足2亿美元,到1990年增至5亿美元。1993年以来世界工业用酶制剂的销售和1997年以来酶制剂在各种应用行业所占的份额概况分别见表1和表2。表11993-2002年世界工业用微生物酶制剂销售概况由上述可得,1990年销售额是1978年的2.5倍,而2002年销售额是1990年的5.14倍;表明1990年以来由于酶制剂的广泛使用,使相关企业在降低生产成本,改善产品品质,减少环境污染等方面获得了显著的效益;又由于微生物产物筛选、发酵和育种技术的改进,特别是遗传工程用于菌种改良,新酶品种不断出现,应用领域继续扩大,使酶的产量迅速增长。再从表2可见

8、,在1997-2002的6年间,酶制剂销售市场在各行业中的分配,食品和饲料业占总额的份额高达45.0%47.0%。洗涤和清洗剂占31.8%33.0%,纺织、制革和毛皮占10.0%11.0%,造纸和纸浆占6.5%7.5%;化学工业占3.7%4.0%。年平均增长率为12.2%,其中造纸和纸浆用酶增长最高,达16.2%。与1985年食品工业占酶制剂市场62%、洗涤用酶占33%、纺织制革占5%相比,洗涤用酶所份额基本保持不变,纺织、制革成倍增长,造纸业增长更快,而食品用酶所份额则相对下降。预计2008年世界酶制剂市场规模将达30亿美元。2我国工业酶制剂生产概况1965年在轻工业部的主持下成立了无锡酶制

9、剂厂,这是我国首家采用现代发酵技术生产酶制剂的专业厂。为了促进微生物工业与酶制剂工业的发展,1970年在中国科学院和原国家科委主持下,举办了全国微生物展览会,同时召开全国酶制剂生产和应用座谈会,轻工业部又于1976年成立了行业协会。至此,全国已开设酶制剂厂近20家。随着改革开放,国外酶制剂产品进入国内市场,接着外资和国外先进技术也被引进。1994年丹麦诺维信(Novozy mes公司的前身诺沃诺德公司董事会通过了在中国实施战略投资计划,迄今已累计投资1.8亿美元,是外商在中国生物技术领域中最大的一笔投资,在北京成立子公司总部和研发中心,在天津、沈阳和苏州建立生产基地,其公司产品占中国工业酶制剂

10、市场的份额高达50%。另一个国际酶制剂工业巨头美国Genecor公司则和我国最大的酶制剂企业无锡酶制剂厂实行强强联合,组建了杰能科(中国生物工程公司,其产品占中国酶制剂市场约20%的份额。外资进入国内市场,带来了先进的生产技术和经营管理模式,促进功能酶制剂工业的发展,当时全国具有一定规模的酶制剂厂约有50家,其中有20多家的产品占国内行业的80%以上,酶制剂品种增加到20余种。1970年我国生产工业酶制剂仅2kt,到1985年增至21kt,15年间产量增加了近10倍;至1995年,与1970年相比,增加了97倍;至2000年,30年间约增加了160倍。1991-2001年我国酶制剂工业生产概况

11、见表3。表319912001年我国工业酶制剂的产量及品种结构淀粉加工用酶/%8687868280818380-其他/%1413141820191720-从表3可见,虽然我国酶制剂产量逐年增加,但酶的品种结构极不合理;1993年以前淀粉加工用酶占总产量的85%以上,1994年以来,由于新产品的增加,上述比例稍有下降,但仍维持在80%左右。国内的酶制剂企业还面临外资企业的激烈竞争,目前市场销售额外资和合资企业约占70%,而非外资企业仅占30%的份额;同时还存在着规模小,菌种选育和发酵水平偏低,生产成本较高,新产品、新技术和新应用领域的研究开发滞后等问题。近年来,由于受全球市场经济一体化的影响,我国

12、的产业结构也在调整,企业也在向规模化、集约化、效益化发展;在工业酶制剂产量增长的同时,企业数减少,品牌集中度提高。目前全国酶制剂生产企业约30余家,其中年产万吨以上的企业达10家,酶制剂的出口量也在逐年增加。企业平均规模增大,加大了技术投入,进行设备改造,引进技术和管理人才,生产的稳定使生产成本进一步下降,增加了企业的风险抵抗和对市场的承受能力,这是中国酶制剂行业走向真正发展的重要标志。3开发酶制剂新品种的重要性和有利条件目前作为生物技术的重要组成部分的酶工程已在国民社会经济中发挥了巨大作用,酶制剂工业得到了迅速发展。酶的特性表现在于常温常压下、简单的设备中即可发生催化反应,其本身为蛋白质,无

13、毒性,易调控,作用底物专一,比一般化学催化剂的效率高,对于在构型不同的物质分子可以起转化或拆分作用,使其广泛地应用在食品、酿造、纺织、制革、造纸、医学、畜牧、日化和环境保护等诸多行业中。纵览当今世界的酶制剂工业研究和发展动向,主要表现在国外酶制剂公司的兼并重组,酶制剂工业的发展具有垄断化趋势,加以大量资源投入,大力开发、研制新酶种和新用途,并应用高新技术生产酶制剂,酶的品种多样化等特点。而我国的酶制剂行业与发达国家相比,与大企业相比,还存在着很大差距,在技术方面表现为:酶的品种少,菌种选育和发酵水平低以及新技术、新产品、新应用领域研究开发滞后等。为使我国酶制剂工业得以健康持续快速的发展,尽快适

14、应国民经济发展的需要,必须加大科技和生产投入,积极推广新技术、新工艺,提高酶的质量,扩大酶的品种范围,加大微生物酶新的菌种开发,以期调整产品结构,参与国际竞争。在这一系列的行动中开发新的微生物酶的品种尤为重要,它对酶产品的结构调整起到了很大作用。同时新的酶品种开发和应用,大多属于自我创新,拥有自主知识产权,有利于推动我国酶制剂行业的高速发展。我国具有新的微生物酶品种开发得天独厚的有利条件。我国微生物资源丰富,从陆生、海洋到极端环境中都可以获得大量产酶微生物菌种,从而发现、研制和开发新酶种;此外我国还拥有历史悠久的固态发酵技术,这为酶的生产打下了良好基础;并且,我国还拥有大批的生命科学工作者,通

15、过他们的努力,再加上新科学、新技术的推广应用,如基因工程、蛋白质工程和定向进化(directed evoluti on 技术以及其他各种高新技术等在新酶种开发中应用。自然界中蕴藏着巨大的微生物资源,这些资源被认为是待开发的优势资源。据测算1g 土壤中含有约1亿个微生物,1mL 海水中也约有10万个真菌、100万个细菌。因此对这两大类资源宝库的开发具有重要意义。我们可以从土壤、腐木筛选相应的产酶微生物,从污水中筛选各种能够产生分解糖类、脂类、蛋白质、纤维素、木质素、环烃、芳香物质、有机磷农药、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物。在极端环9第1期潘仁瑞,等:微生物酶资源的开发和利用(上01合肥

16、学院学报(自然科学版第15卷境条件下,可筛选嗜热微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、耐高压微生物等,并开发极端微生物酶品种。此外,还应加大海洋微生物分离鉴定工作,建立微生物培养体系和相关酶活力测定手段和方法,探索新的酶种。4快速开发具有应用价值新酶的途径微生物在自然界数十亿年的进化过程中,各类微生物都形成了一套适合自身在不同环境条件下进行新陈代谢的酶系。当人们将这些生物催化剂应用于工业过程中进行催化反应时,由于酶是由蛋白质构成,常常遇到酶的稳定性下降,不能适应极端的工艺条件,以及产物的抑制作用等问题。为了寻找具有新的功能和特性的酶,传统的方法是从自然界分离新的菌种,通过筛选获得新酶,再

17、通过人工突变,筛选适合工艺条件的酶系,然后进行工业生产。但这一过程费时较长,经常要花费数年时间的努力。另一条途径是改造现有的酶,在20世纪60年代,主要采用对酶分子进行修饰或固定化处理;70年代开始采用基因工程的方法,来提高酶的产量。80年代又出现以计算机三维结构模拟预测和基因定点突变为基础的蛋白质工程,通过改变酶基因DNA的某些核苷酸序列,从而改变酶蛋白的某些特性,例如提高热稳定性、pH适应性、抗氧化等特性。但这一技术的应用必须了解酶蛋白的一级结构和三维空间结构,搞清楚结构与功能之间的关系,所以其应用面有一定的局限性;而在我国目前的技术条件下,也要经过数年的努力才能达到这一要求。微生物的蛋白

18、质基因在自然进化的过程发生突变的几率较小,自然选择使进化方向有利于生物适应生活环境的方向发展;人工选择则可使进化朝适合人类需求的方向发展。人们设想是否可以在实验室模仿自然进化的过程,在短时间内完成漫长的自然进化过程。关于蛋白质和酶分子体外分子进化(in vitr o molecular evoluti on的研究,归纳起来有两种设计理念:一种是理性的设计(rati onal design在已经获得蛋白质晶体结构信息的情况下,按照计算机模拟试验的预测,然后进行定点突变以改造蛋白质的性状,即上面提到的蛋白质工程;另一种是非理性的设计,由于对于大多数蛋白质分子的空间结构了解甚少,则可以根据人为设定的

19、目标,对特定蛋白质的性质,通过DNA分子随机突变、随机重组和定向筛选,使之适合人类的需要,可以在较短时间内完成漫长的自然进化过程,这一技术被称之为定向进化。美国Affy max研究院的Ste mmer在1994年首先报道了一种简单、快速而有效的体外定向进化技术,称之为DNA随机拼接(DNA shuffling,可以对单一基因、家族基因、质粒、代谢途径、部分甚至整个基因组进行改造。现将其操作流程和基本原理简介如下:(1在获得目的基因的DNA片段后,在Dnase I的作用下随机消化,随机片段的大小,视整个目的DNA的长度而定,通常是50100bp。(2进行无引物的PCR/重组装PCR(rease

20、mbly PCR:由于没有额外添加引物,在变性、退火过程中,在DNA聚合酶的作用下,根据不严格的序列同源性,小片断间会进行随机的群体性配对(pool w ise。由于配对的不精确性,就会引入突变和重组,其突变形式多样,包括点突变、缺失、插入、颠倒、整合等类型。经过多轮循环,不断延伸,并重新组装成完整长度的核酸序列,这一过程称之为再组装PCR。(3引物PCR、基因表达和筛选:添加引物进行常规PCR,以扩增无引物PCR中产生的重组装产物,然后将其插入合适的表达载体,转化宿主进行表达,通过选择压力的设置、模型的建立进行定向选择或筛选。筛选方法可以采用常规的琼脂平皿,根据目的不同选择特定的底物,有的可

21、再加颜色指示剂,根据菌落周围透明圈或颜色圈来选择阳性突变体,淘汰阴性和中性的突变体,但此法不能精确定量。也可采用高通量筛选(H igh thr oughput screening,此法是以96-微孔板或384-微孔板作为实验工具,酶作用的底物和生成的产物不必分离,以自动化系统执行实验过程,以灵敏快速的检测仪器采集数据,例如荧光检测系统,用计算机处理数据。使检测过程标准化、定量化,大大加快筛选速度。利用此筛选程序能鉴定出酶对底物的特异性、热稳定性、对映体选择性及其他特定的性状。所获得的阳性突变体,可以作为下一轮筛选的目的基因。用于定向进化的方法还有:通过易错PCR(err or p r one

22、PCR或致突变菌株(mutalt or strain产生随机突变、化学诱变剂介导的随机突变、限制性酶切再连接介导的基因重组(Recombining the genes by re2stricti on and religati on、随机引导重组(Rando m p ri m ing recombinati on和交错延伸技术(Staggered extensi on p r ocess等。利用定向进化的方法改造工业用酶已取得初步成效:Ste mmer(1994使-内酰胺酶对新底物cef o2 taxi m e的活性提高了32000倍,酶分子中有6个氨基酸发生突变。Zhang等(1997改造-

23、半乳糖苷酶,其底物特异性提高了1000倍,酶活性提高66倍,有6个氨基酸发生突变。Zhao等(1998在保持酶活力不变的条件将枯草杆菌蛋白酶E的作用温度提高了17,Matsu mura等(1999提高了-葡萄糖苷酸酶对戊二醛和甲醛的抗性,酶分子有6个氨基酸发生突变。以上是单基因酶定向改造的几个实例,对于家族基因酶的应用也有报道。Giver等(1998使对-硝基苯酯酶的活力提高了56倍,热稳定性的T m值提高14。Ku ma maru等(1998报道能提高联苯双加氧酶对环境污染物聚氯化联苯降解的底物专一性和活性。Kikuchi等(1999使儿茶酚双加氧酶的热稳定性提高了1326倍。利用DNA随机拼接技术,通过多种突变,可以有效协调一个代谢途径中不同基因间的相互作用,使总的代谢效果迅速进化。例如,Cra men等(1997报导应用于砷酸盐的解毒途径,使对砷酸盐的抗性提高40倍,这是用其他策略难以做到的。5微生物酶的应用方式酶的应用方式可以是直接使用某一种酶催化某一化学过程