纳米金合成_表面修饰及生物应用

1、上海交通大学硕士学位论文 纳米金合成、表面修饰及生物应用Synthesis of gold nanoparticles surface modification and bioapplications 专 业：分析化学 班 级：B0911092 学 号：1091109051 学 生：高杰 导 师：任吉存 教授 上海交通大学化学化工学院 2011 年 12 月 上海交通大学学位评定委员会办公室上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其

2、他 个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人 和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本 人承担。 学位论文作者签名： 日期： 2011 年 12 月 20 日 1上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在 年解密后适用本授

3、权书。 本学位论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“”）学位论文作者签名： 指导教师签名：日期： 2011 年 12 月 20 日 日期：2011 年 12 月 20 日 2上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 纳米金合成、表面修饰及生物应用 摘 要 近来年，金纳米粒子因其独特的物理化学性质而受到越来越广泛的关注，并逐渐被当作光学探针和生物相容性材料来使用。但它也存在容易发生团聚的缺陷，尤其是在高盐或者核酸、蛋白质等生物分子存在的条件下。所以，如何提高纳米金粒子在水溶液及生物连结过程中的稳定性是它在生物医学领域应用过程中的关键问题。在本研究课题中，我们首先合成了不同长径比的金纳米棒和纳米球

4、，并用紫外-可见吸收光谱仪、透射电镜和荧光相关光谱对其进行了表征。结果表明合成的纳米粒子粒径均匀，分散性好。 然后，我们以 17 纳米金球研究模型，系统的研究了某些巯基化合物对纳米金的稳定性影响。在研究中，用谷胱甘肽、巯基丙酸、半胱氨酸、胱胺、二氢硫辛酸和巯基聚乙二醇六种含巯基配体对纳米金进行了表面修饰。我们以紫外-可见分光光度计，荧光相关光谱，粒度仪和 Zeta 电位仪为表征手段，系统地研究了巯基化合物修饰纳米金球在不同 pH 值及盐浓度溶液中的稳定性。结果发现，用巯基聚乙二醇修饰的纳米金的稳定性明显高于用其它五种配体修饰的金。巯基聚乙二醇修饰的纳米金甚至在 1 M NaCl 溶液中具有很好

5、的稳定性。由于巯基聚乙二醇在结构上不存在羧基、氨基等官能团，限制了它在后序生物领域的应用。因此，我们设计了一种用巯基丙酸和巯基聚乙二醇的混合物同时对金纳米球进行修饰的方法，该方法不仅大大提高了金纳米在溶液中的稳定性，同时使其表面拥有了羧基官能团。我们用双配体修饰的金纳米球以 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐为连接试剂成功标记表皮生长因子受体高表达的人子宫颈癌细胞（SiHa 细胞）并用暗场成像技术对标记的细胞进行成像。相比目前常用的以金纳米作为分子探针标记细胞的其它方法相比，我们的方法操作简单成本低廉，在未来的生物测定与癌症诊断研究方向具有广阔的应用

6、前景。上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论关键词：金纳米颗粒，含巯基配体，生物连接，暗场成像上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 Synthesis of gold nanoparticles surface modification and bioapplications ABSTRACTCurrently gold nanoparticles GNPs are attractive alternative optical probes and goodbiocompatible materials due to their special physical and chemical p

7、roperties. HoweverGNPs have a tendency to aggregate particularly in the presence of high salts and certainbiological molecules such as nucleic acids and proteins. How to improve the stability ofGNPs and their bioconjugates in aqueous solution is a critical issue in the bioapplications. Inthis study

8、we firstly prepared four kind of gold nanorods with different ratios of long andshort radius then characterized them using UV-Vis spectroscopy TEM and FluorescenceCorrelation Spectroscopy FCS. Furthermore we used 17 nm GNPs as a model andmodified them with six thiol compounds including glutathione m

9、ercaptopropionic acidMPA cysteine cystamine dihydrolipoic acid DHLA and thiol-ended polyethylene glycolPEG-SH via Au-S bond. We systematically investigated the effects of thiol ligands pH andsalt concentrations of solutions on colloidal stability to GNPs using UV-Vis absorptionspectroscopy fluoresce

10、nce correlation spectroscopy FCS and Zeta potential instrument. Wefound that GNPs modified with PEG-SH were the most stable in aqueous solution comparedto other thiol compounds. Based on the results above we developed a simple and efficient上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论approach for modification of GNPs using a

11、 mixture of PEG-SH and MPA as ligands. Thesebi-ligands modified GNPs were facilely conjugated to antibody using EDC 1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide and N-hydroxysulfo-succinimide Sulfo-NHS aslinkage reagents. We conjugated GNPs to epidermal growth factor receptor EGFRantibodies and succ

12、essfully used the antibody-GNPs conjugates as targeting probes forimaging of cancer cells using the illumination of dark field. Compared to current methods formodification and conjugation of GNPs our method described here showed simple low-costand have potential applications in bioassays and cancer

13、diagnostics and studies.Keywords: Gold nanoparticles Thiol-ligands Bioconjugation Dark field imaging上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 目录第一章 绪论 . 1 1.1 金纳米颗粒 . 1 1.2 金纳米球的合成 . 1 1.3 金纳米棒的合成 . 3 1.4 金纳米的表征 . 7 1.5 金纳米粒子的修饰 . 10 1.6 金纳米粒子的光学特性及应用 . 11 1.6.1 金纳米粒子的光学特性 . 11 1.6.2 金纳米粒子的应用 . 13 1.7 本论文的选题思路 . 17参考文献 .

14、 18第二章 金纳米的合成及修饰 . 25 2.1 引言 . 25 2.2 实验部分 . 26 2.2.1 试剂与仪器 . 26 2.2.2 实验方法 . 27 2.3 结果与讨论 . 30 2.3.1 金纳米棒的表征 . 30 2.3.2 金纳米球的表征 . 32 2.3.3 修饰后的金纳米球在不同环境的稳定性考察 . 35 2.4 本章小结 . 41参考文献 . 42第三章 金纳米的生物应用 . 44 3.1 引言 . 44 3.2 实验部分 . 45 3.2.1 试剂与仪器 . 45 3.2.2 实验方法 . 46 3.3 结果及讨论 . 47 3.3.1 MPA 与 SH-PEG 双配

15、体修饰后的金连接抗体前后的稳定性比较 . 47 3.3.2 双配体的比例筛选 . 49 3.3.3 暗场成像 . 50上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 3.4 本章小结 . 52参考文献 . 53致谢 . 55攻读硕士期间学术论文发表情况 . 56 上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 第一章 绪论1.1 金纳米颗粒 近年来，贵金属纳米颗粒以其独特的性质尺寸依赖的电学性质、光学特性、 磁性和化学性质，吸引了不同领域的关注，科学家们不仅对其光量子限域效应、磁 量子限域效应及其它纳米材料特有属性进行研究，也越来越广泛地将其应用到感光、 催化、生物标识、光子学、光电子学、信息存储、表面增强拉

16、曼散射等诸多领域 1-18。 金属纳米颗粒尤其是金纳米颗粒的尺寸、形状和结构控制以及相应的物理性质 一直是材料科学以及相关领域的前沿热点。近几年来，对于金纳米材料的研究取得 了长足进步，科学家们不但研究出制备不同尺寸的球形粒子、不同长短径比的棒状 粒子的方法，还可以用非常简便的方法对其形貌加以控制，制备出了许多不同形貌 的一维材料，并发现它们具备的一些特殊的实验现象和物理性质。许多科研小组在 这方面已取得了重大成果，并且成功将其应用到生物、医学、信息存储等领域。 19-271.2 金纳米球的合成 纳米尺寸的金颗粒具有很多独特的性质无细胞毒性、良好的生物相容性、 易于合成及表面修饰、强烈的光吸收

17、与散射、超高的光热转换效率及光化学稳定性 等28-33，从而逐渐成为科学领域的一个热门话题，在物理、化学、生物、医学 以及催化等诸多领域得到广泛地应用。 金属纳米粒子的主要制备方法有物理法和化学法，其中物理法主要有真空蒸镀 法、软着陆法、电分散法和激光消融法等，化学法主要有氧化还原法、34-36电 化学法、37晶种法、38-40微乳液法、41-42相转移法、43-47模板法48 1 上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 和光化学法。49-51接下来主要介绍文献报道的合成金纳米粒子常用的方法。 氧化还原法： 该法通常是在含有高价金离子的溶液中加入还原剂，金离子被还原而聚集成纳 米粒子。所用的还

18、原剂包括经典的柠檬酸三钠、硼氢化钠、磷、十六烷基苯胺、聚 乙二醇、聚苯胺等。其中以柠檬酸钠还原法最为经典，就是以柠檬酸三钠为还原剂， 在热的水溶液中将AuCl4-还原，其制备方法简单，所得到的颗粒性质稳定34。 Yonezawa35-36等随后又相继以巯基丙酸钠及氟化烷醇类化合物为稳定剂，将它 们各自与硼氢化钠同时加入氯金酸溶液中，制得了巯基丙酸盐和碳氟化合物稳定的 金纳米颗粒。他们还合成了具有 4 条链的充当稳定剂的二硫化物配体， 采用这种 配体能更好地控制所制备的纳米微粒的粒径，进一步扩展了硼氢化钠还原法的应用 范围。 微乳液法： 该法是将表面活性剂溶解在有机溶剂中，当表面活性剂的浓度超过

19、临界胶束浓 度（CMC）后形成亲水极性头向内、疏水有机链向外的液体颗粒结构，其内核可增 溶水分子或亲水物质。微乳液一般由 4 种组分组成，即表面活性剂、助表面活性剂（一般为脂肪醇）、有机溶剂（一般为烷烃或环烷烃）和水。它是一种热力学稳定体 系，可以合成大小均匀、粒径在 10nm20nm 的液体颗粒。Chiang41报道了在由水、 异新烷、阴离子表面活性剂气溶胶和非离子表面活性剂山梨醇脂肪酸酯形成的微乳 液中，用肼还原氯金酸，形成稳定的、各向异性的金纳米粒子。Esumi42报道了 在 2-乙烯基吡啶调聚物存在的条件下，在水中用硼氢化钠还原氯金酸制得金纳米粒 子。这种方法本身相对复杂，但获得的金纳

20、米颗粒粒径小，稳定性高，且易于与反 应体系分离。 晶种生长法： 晶种生长法是通过晶种合成以及晶咱成长分布反应制备金纳米颗粒，该法优点 在于比一步法得到的颗粒粒径分布窄。 Natan38-39等以柠檬酸钠还原氯金酸制得粒径为 50±5nm 的纳米颗粒。在以 此为晶种，加入适量的氯金酸和羟胺，利用金纳米颗粒表面的自催化反应使晶种逐 渐生长。反应过程中，可以通过控制反应条件最终制备出粒径在 50110nm 之间的 2 上海交通大学硕士学位论文 第一章 绪论 金纳米球。Jana40等人利用柠檬酸钠还原法制备 3.5nm 的晶种，用十六烷基三甲 基溴化铵（CTAB）作为稳定剂，抗坏血酸为还原剂

21、，制备出粒径均一性很好的金 纳米颗粒，通过调节金核和金盐的比例，还可以实现对其粒径大小的控制。1.3 金纳米棒的合成 金纳米棒具有横向和纵向表面等离子共振（Longitudinal Surface Plasmon Resonance LSPR）峰，其独特的物理化学性质及光学性质，在生物和医学领域被 广泛应用。金纳米棒有多种合成方法，包括模板法、52电化学方法、53-54光 化学方法55以及晶种生长方法56-68等。其中又以晶种生长法最为简单和常用。 晶种生长法： 晶种生长法因其合成过程简便、高产量、长短径比可控及表面易于修饰等优点而成 为合成胶体金纳米棒最流行的方法。其基本原理是在反应溶液中加入一定量的金纳 米颗粒晶种，在表面活性剂分子的作用下，晶种颗粒定向生长为一定径直比的金或 银纳米棒。这种方法可以追溯到 1989 年 Wiesner 和 Wokaun69等报道的以磷还原 氯金酸得到的晶核为种子溶液，以过氧化氢为引发剂合成非等轴的金纳米棒。当今 晶种生长法的概念源自 2001 年 Jana56-57的报道，他们以柠檬酸