微生物学实验34-cmx2011

1、实验实验3 实验室环境及人体表面微生物的检查分离实验室环境及人体表面微生物的检查分离目的要求目的要求 1.证实实验室环境与人体表面存在微生物。证实实验室环境与人体表面存在微生物。 2.体会无菌操作的重要性。体会无菌操作的重要性。 3.观察不同类群微生物的菌落形态特征。观察不同类群微生物的菌落形态特征。 4.无菌操作，将分离的典型菌落划线培养于固体无菌操作，将分离的典型菌落划线培养于固体斜面。斜面。原理 通过培养的方法使通过培养的方法使 肉眼看不见的单个菌体在固体肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的菌落。一

2、起的肉眼可见的菌落。实验试剂等 LB平板（每组平板（每组3个）个） 无菌水无菌水 医用无菌棉签（若干）医用无菌棉签（若干） 标签纸若干标签纸若干操作步骤1.做好标记做好标记2.不同样品采集不同样品采集3.平板倒扣平板倒扣30或室温培养或室温培养1-2dabcd请注意无菌操作 姓名、日期姓名、日期实验报告 根据根据p8表格填写实验报告。表格填写实验报告。同学们自己分离的菌株的纯化 1.确定已经分离的目的菌株，并对菌株命名，如菌株cmx1、菌株Air1 2. 对目的菌株进行纯化（3次以上划线培养纯化单菌落） 3. 斜面培养并暂时保种斜面培养并暂时保种实验实验4 4 显微镜的使用及细菌显微镜的使用及

3、细菌 的简单染色法的简单染色法注意 显微镜有编号，显微镜有编号， 按号使用。按号使用。 显微镜存放柜显微镜存放柜 1-1 1-21 6 112 7 123 8 134 9 145 10 152 7 123 8 134 9 145 10 15p436. 双眼同时睁开观察，减少眼睛疲劳，且可同时画双眼同时睁开观察，减少眼睛疲劳，且可同时画图和记录。图和记录。7. 可不佩戴眼睛操作，注意不要压破载玻片，不触可不佩戴眼睛操作，注意不要压破载玻片，不触碰样品处碰样品处8. 双眼聚焦于同一个视野。双眼聚焦于同一个视野。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，难于辨别细菌细胞的简单染色法是只用

4、一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，难于辨别细菌细胞的构构造。造。 用于生物染色的染料主要有用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中碱性染料、酸性染料和中性染料性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用通常采用碱性染料碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的

5、物质结合。色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料如伊红着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。美蓝、伊红天青等。三、实验材料 奥林巴斯普通光学显微镜（复式显微镜）奥林巴斯普通光学显微镜（复式显微镜） 同学们分离纯化培养的不同菌株同学们分离纯化培养的不同菌株 草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染液草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸

6、复红染液 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。镜纸、吸水纸等。（一）、制作细菌观察片（简单染色）（一）、制作细菌观察片（简单染色） （1）涂片）涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，用另外一个载玻片向一侧推菌与水滴充分混匀，用另外一个载玻片向一侧推菌悬液滴一次，涂成薄膜，涂布面积约悬液滴一次，涂成薄膜，涂布面积约11.5cm2。 （2）干燥）干燥 将涂片于室温中自然干燥。将涂片于室温中自然干燥。 （3

7、）固定）固定 手执载片手执载片端，使涂菌的一面向上，端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火将载片通过微火23次。在火上固定时，用手摸次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。否则细菌形态毁坏。 （4）染色）染色 将涂片置于水平位置，滴加将涂片置于水平位置，滴加几滴几滴染色液覆盖于染色液覆盖于涂菌处，染色约涂菌处，染色约2min。 （5）水洗）水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，

8、直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。下的水中无染色液的颜色为止。 （6）干燥）干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体。掉菌体。 （7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。典型部位移至视野中央，再用油镜观察。一一二甲苯有毒，同学请注意安全，且会腐蚀镜头，不宜使用过多二甲苯有毒，同学请注意安全，且会腐蚀镜头，不宜使用过多注意事项 1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多（滴水不要过多（1小黄

9、豆），挑菌量宜适中，菌膜小黄豆），挑菌量宜适中，菌膜宜薄，切忌过厚（不要来回涂抹）。宜薄，切忌过厚（不要来回涂抹）。 2在染色过程中，不可使染液干涸。在染色过程中，不可使染液干涸。 3. 无菌操作，接种环一定要冷却后再取菌。无菌操作，接种环一定要冷却后再取菌。 4.涂片干燥后加热固定，加热时间不宜过长（涂片干燥后加热固定，加热时间不宜过长（3-6次）次）问题和思考 1涂片在染色前为什么要先进行固定涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应固定时应注意什么问题注意什么问题? 2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？ 3.使用油镜时，为什么必须用香柏油？使用油镜

10、时，为什么必须用香柏油？ 4.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？直接用高倍镜或油镜观察？五、实验报告 (一一) 菌株简介菌株简介 (二二)绘图（细菌形态图）绘图（细菌形态图）菌株菌株SJJM光学显微镜图（简单染色）光学显微镜图（简单染色） 放大倍数：放大倍数：1000 解析：该菌菌落为乳白色，来源于水体环境，细菌菌体为椭圆形，大小解析：该菌菌落为乳白色，来源于水体环境，细菌菌体为椭圆形，大小均匀。均匀。画图要求画图要求1.具有高度的科学性，不得有科学性具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，错误。形态

11、结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。要求真实感，立体感，精美而美观。 2.图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。尽量少用橡皮。 3.绘图大小要适宜，位置略偏左，右绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。边留着注图。 4.绘图的线条要光滑、匀称，点点要绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。大小一致。 5.绘图要完善，字体用正楷，大小要绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。 6.绘图完成后在图的下方注明图名及绘图完成后在图的下方注明图名及放大倍数放大倍数点评