第十三章生化药物和基因工程药物分析概念PPT学习教案

1、会计学1第十三章生化药物和基因工程药物分析第十三章生化药物和基因工程药物分析概念概念第1页/共64页人类用于预防、治疗和诊人类用于预防、治疗和诊断疾病的三大主要药物断疾病的三大主要药物第一节第一节 概概 述述化学药物化学药物生物药物生物药物中中 药药第2页/共64页生物药物的定义：生物药物的定义： 利用利用生物体、生物组织或器官生物体、生物组织或器官等成等成分，综合运用生物学、生物化学、微生分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。与方法制得的一大类药物。第3页/共64页生物药物的分类：生物药物的分类：生化药物

2、生化药物生物技术药物生物技术药物生物制品生物制品从生物体分离纯化制得的生化基从生物体分离纯化制得的生化基本物质，以及用化学合成、微生本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的一物合成或现代生物技术制得的一类药物。类药物。利用生物体或其组成部分利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系即现发展产品的技术体系即现代生物技术研制的药物称代生物技术研制的药物称之。之。应用普通的或基因工程应用普通的或基因工程、细胞工程、蛋白质工、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制织和体液

3、等生物材料制备，用于人类疾病预防备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。、治疗和诊断的药品。第4页/共64页一、生化药物和基因工程药物的定义一、生化药物和基因工程药物的定义1 1、生化药物的定义、生化药物的定义 从动物、植物及微生物提取的，也从动物、植物及微生物提取的，也可用生物化学半合成或用现代生物技可用生物化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等。解物以及大分子的结构修饰物等。第5页/共64页2 2、基因工程药物的定义、基因工程药物的定义 先确定对某种疾病具有预防和治疗作先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白

4、质，然后将控制该蛋白质合成过用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因进行分离、纯化或人工合成，利程的基因进行分离、纯化或人工合成，利用重组用重组DNADNA技术加以改造，最后将该基技术加以改造，最后将该基因导入可以大量生产的受体细胞中不断繁因导入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达，并能进行大规模生产具有预防殖或表达，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的药物称之。生产的药物称之。第6页/共64页1 1、氨基酸、多肽与蛋白质类药物、氨基酸、多肽与蛋白质类药物二、生化药物和基因工程药物的种类二、生化药物和基因工程药物的种类（

5、一）生化药物的种类（一）生化药物的种类（1 1）氨基酸及其衍生物：）氨基酸及其衍生物： 单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。第7页/共64页 氨基酸衍生物：氨基酸衍生物：N-N-乙酰乙酰-L-L-半胱氨酸半胱氨酸、S- S-氨基甲酰半胱氨酸、氨基甲酰半胱氨酸、S- S-甲基半胱氨甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、酸、谷胺酰胺、S- S-羟色氨酸。羟色氨酸。 复合氨基酸注射液：复合氨基酸注射液：3S3S、6S6S、9S9S、11S11S、13S13S、14S14S、15S15S、17S17S、18S18S复合氨复合氨基

6、酸注射液。（基酸注射液。（S S代表氨基酸的种类）代表氨基酸的种类）第8页/共64页（2 2）多肽类药物）多肽类药物 ： 垂体多肽：促肾上腺皮质激素、促垂体多肽：促肾上腺皮质激素、促胃液素、加压素。胃液素、加压素。 消化道多肽：促胰液素（胰泌素）消化道多肽：促胰液素（胰泌素）、胃泌素、抑胃肽。、胃泌素、抑胃肽。 下丘脑多肽：促甲状腺素释放激素下丘脑多肽：促甲状腺素释放激素、促性腺激素释放激素、生长激素释、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素。放激素。第9页/共64页 脑多肽：由人及动物脑和脑脊液中脑多肽：由人及动物脑和脑脊液中分离出来的多肽、蛋氨酸脑啡肽和亮氨分离出来的多肽、蛋氨酸脑啡肽和亮氨

7、酸脑啡肽等。酸脑啡肽等。 激肽类：血管紧张肽激肽类：血管紧张肽I I、II II、IIIIII等活性等活性肽。肽。 其它肽类：谷脱甘肽、降钙素、睡其它肽类：谷脱甘肽、降钙素、睡眠肽、松果肽、血活素（分子量为眠肽、松果肽、血活素（分子量为30003000的肽为主成分的肽为主成分) )。第10页/共64页（3 3）蛋白类药物）蛋白类药物 猪或牛的纤维蛋白原、纤维蛋白、猪或牛的纤维蛋白原、纤维蛋白、胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝细胞生胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝细胞生长因子；属长因子；属蛋白质类激素蛋白质类激素尚有生长素、尚有生长素、催乳素、促甲状腺素、促泡激素（催乳素、促甲状腺素、促泡激素（FSHF

8、SH）、促黄体激素（）、促黄体激素（LHLH）；）；植物来源的植物来源的蛋白类药物蛋白类药物有植物凝集素、天花粉蛋白有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。、蓖麻和相思豆毒蛋白等。第11页/共64页2 2、酶类药物、酶类药物（1 1）助消化酶类：胃蛋白酶、胰蛋白）助消化酶类：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。（2 2）蛋白水解酶类：溶菌酶、胰）蛋白水解酶类：溶菌酶、胰DNADNA酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。（3 3）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（猪、）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（猪、牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶牛血）、纤溶酶、尿

9、激酶、蛇毒凝血酶。第12页/共64页（4 4）抗肿瘤酶类：）抗肿瘤酶类：L- L-天门冬酰胺酶、甲天门冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5 5）其它酶类：细胞色素）其它酶类：细胞色素C C、超氧化物、超氧化物歧化酶（歧化酶（SODSOD）、）、RNARNA酶、青霉素酶。酶、青霉素酶。（6 6）辅酶：）辅酶：CoACoA、黄素单核苷酸（、黄素单核苷酸（FMNFMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FADFAD）。 第13页/共64页3 3、多糖类药物、多糖类药物（1 1）肝素、硫酸软骨素）肝素、硫酸软骨素A A和和C C、硫酸皮、硫酸皮肤

10、素（硫酸软骨素肤素（硫酸软骨素B B）、硫酸角质素、）、硫酸角质素、透明质酸等。透明质酸等。（2 2）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、糖、壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓多糖、人参多糖、黄芪多糖等。猪苓多糖、人参多糖、黄芪多糖等。第14页/共64页4 4、脂质类药物、脂质类药物 卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、麦角固卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、麦角固醇、醇、B B谷固醇、胆汁酸（胆酸与甘氨酸谷固醇、胆汁酸（胆酸与甘氨酸或牛黄酸的结合物）、鹅脱氧胆酸、胆或牛黄酸的结合物）、鹅脱氧胆酸、胆红素、原叶琳、血叶琳、亚油酸、花生红素、原叶琳、血叶琳、亚油

11、酸、花生四烯酸、五四烯酸、五- -六烯酸、前列腺素系列（六烯酸、前列腺素系列（PGE1PGE1、PGE2PGE2、PGE2aPGE2a和和PG12PG12）。）。第15页/共64页5 5、核酸类药物、核酸类药物 RNA RNA（包括（包括iRNA-iRNA-免疫核糖核酸）、免疫核糖核酸）、DNADNA（脱氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巯（脱氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巯基聚胞苷酸、基聚胞苷酸、cAMPcAMP、AMPAMP、肌苷。、肌苷。 此外，有核酪制剂，此外，有核酪制剂，6-6-巯基嘌呤、巯基嘌呤、6-6-硫代嘌呤、硫代嘌呤、5-5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-5-碘苷和无环鸟苷等。

12、碘苷和无环鸟苷等。第16页/共64页二、基因工程工药物的种类二、基因工程工药物的种类1 1、激素类及神经递质类药物、激素类及神经递质类药物（1 1）人生长激素释放抑制因子）人生长激素释放抑制因子（2 2）人胰岛素）人胰岛素（3 3）人生长激素）人生长激素2 2、细胞因子类药物、细胞因子类药物（1 1）人干扰素）人干扰素第17页/共64页（2 2）人白细胞介素）人白细胞介素（3 3）集落刺激因子）集落刺激因子（4 4）促红细胞生长素）促红细胞生长素3 3、酶类及凝血因子类药物、酶类及凝血因子类药物 单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、反义药物、肿瘤、白

13、介素、生长因子、反义药物、肿瘤坏死因子等。坏死因子等。第18页/共64页1 1、共同特点：、共同特点： 具有一定的具有一定的生物活性或生理功能生物活性或生理功能，能够参与、影响和调控人体代谢和，能够参与、影响和调控人体代谢和生理功能，对于某些疾病的治疗具有生理功能，对于某些疾病的治疗具有针对性强、毒副作用小、易为人体所针对性强、毒副作用小、易为人体所吸收等特点。吸收等特点。三、生化药物和基因工程药物的特点三、生化药物和基因工程药物的特点第19页/共64页2 2、分子量不是定值、分子量不是定值 除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激素等属化学结构明确的小分子化合物外素等属化

14、学结构明确的小分子化合物外，大部分为大分子物质，大部分为大分子物质，其分子量一般其分子量一般几千至几十万几千至几十万。对大分子的药物而言，。对大分子的药物而言，即使组分相同，往往由于分子量不同而即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。产生不同的生理活性。第20页/共64页 3 3、结构确证难、结构确证难 在此类药物中，由于在此类药物中，由于有效结构或有效结构或分子量不确定分子量不确定，其结构的确证很难沿，其结构的确证很难沿用元素分析、用元素分析、IRIR、UVUV、NMRNMR、MSMS等等方法加以证实，往往还要用方法加以证实，往往还要用生化法生化法如如氨基酸序列等法加以证实。氨

15、基酸序列等法加以证实。第21页/共64页4 4、全过程的质量控制、全过程的质量控制 此类药物对热、酸、碱、重金属以此类药物对热、酸、碱、重金属以及及pHpH较敏感，需对原材料、生产过程较敏感，需对原材料、生产过程和最终产品进行质量控制。和最终产品进行质量控制。第22页/共64页5 5、生物活性检查、生物活性检查 在制备多肽或蛋白质类药物时，在制备多肽或蛋白质类药物时，有时因工艺条件的变化，导致有时因工艺条件的变化，导致蛋白质蛋白质失活失活。因此，除了用通常采用的理化。因此，除了用通常采用的理化法检验外：尚需用生物检定法进行检法检验外：尚需用生物检定法进行检定，以证实药物的生物活性。定，以证实药

16、物的生物活性。 第23页/共64页6 6、安全性检查、安全性检查 由于此类药物性质特殊，生产工艺由于此类药物性质特殊，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常需做安全性检查。需做安全性检查。7 7、效价测定、效价测定 对酶类药物需进行效价测定或酶活对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低力测定，以表明其有效成分含量的高低。第24页/共64页第二节第二节 质量检验的基本程序与方法质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验一、鉴别试验（一）理化鉴别法（一）理化鉴别法 利用化学法、物理法及生物学方法利用化学法、物理法及生物学方法来确证生化药物的

17、真伪。用标准品或对来确证生化药物的真伪。用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。照品在同一条件下进行对照试验。第25页/共64页1 1、化学反应法、化学反应法 通常利用药物与某试剂在一定条件通常利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法鉴别。例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法；胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法。；胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法。 2 2、HPLCHPLC法法第26页/共64页3 3、UVUV法法 三磷酸腺苷二钠的分子中具有共轭三磷酸腺苷二钠的分子中具有共轭系统，能吸收紫外光。本品的系统，能吸收紫外光。本品的L

18、L盐酸盐酸水溶液（水溶液（20g20gmlml），在（），在（2572571 1）nmnm的波长处有最大吸收。的波长处有最大吸收。A250nmA250nmA260nmA260nm的值应为。的值应为。第27页/共64页（二）生化鉴别法（二）生化鉴别法 1 1、酶法：、酶法：尿激酶尿激酶是专属性较强的蛋白是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激酶能激活牛纤维蛋白水解酶，根据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原，而具有相同作用的溶酶原，而具有相同作用的链激酶链激酶不能不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作为

19、判断指标。升法作为判断指标。 第28页/共64页2 2、电泳法、电泳法 肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由素是由D-D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标用下，向正极方向移动，与肝素国家标准品对照，其移动位置应相一致。准品对照，其移动位置应相一致。 第29页/共64页3 3、样品脱盐后等电点聚焦法测定、样品脱盐后等电点聚焦法测定 测定药物的等电点（为出现多条区测定药物的等电点（

20、为出现多条区带多个等电点），同批次同一产品的等带多个等电点），同批次同一产品的等电点应相同，表明其工艺稳定。电点应相同，表明其工艺稳定。（三）（三）生物鉴别法：利用生物体进行试生物鉴别法：利用生物体进行试验来鉴别药物。验来鉴别药物。第30页/共64页二、杂质检查二、杂质检查（一）一般杂质检查（一）一般杂质检查 检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。失重、炽灼残渣等。第31页/共64页（二）特殊杂质检查（二）特殊杂质检查

21、许多药物是从生物组织中提取或用许多药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。杂质或其他成分。1 1、原料药的纯度分析、原料药的纯度分析2 2、生产过程中杂质检查、生产过程中杂质检查第32页/共64页三、安全性检查三、安全性检查（一）（一）热原热原检查法（家兔、检查法（家兔、鲎鲎试剂）试剂）（二）异常毒性试验（二）异常毒性试验 ：用一定剂量的：用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡毒性反

22、应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点。与否为终点。 第33页/共64页（三）过敏试验（检查（三）过敏试验（检查异性蛋白异性蛋白） 药物中若夹杂有异性蛋白，在临床药物中若夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人多种过敏反应，轻者使用时易引起病人多种过敏反应，轻者皮肤出现红斑或丘疹，严重者可出现窒皮肤出现红斑或丘疹，严重者可出现窒息、发结、血管神经性水肿、血压下降息、发结、血管神经性水肿、血压下降，甚至休克和死亡。，甚至休克和死亡。第34页/共64页（四）（四）降压物质降压物质检查法检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或致血压降

23、低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。其他导致血压降低的物质。来源来源：用动物脏器或组织为原料制备生化：用动物脏器或组织为原料制备生化药物，正常组织内存在的组胺及部分氨基药物，正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质。酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质。第35页/共64页（五）无菌检查法（五）无菌检查法 （检查（检查活菌活菌） 由于许多药物是在无菌条件下制备由于许多药物是在无菌条件下制备的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查就更有必要。中国药典中几乎所有的注就更有必要。中国药典中几乎所有的注射用药如注射用尿激酶等，均做无菌检射用药

24、如注射用尿激酶等，均做无菌检查。查。第36页/共64页1 1、无菌检查的基本步骤：、无菌检查的基本步骤： 培养基的制备，为细菌生长、繁殖提供所培养基的制备，为细菌生长、繁殖提供所必需的营养物质必需的营养物质碳源、氮源、维生素、矿碳源、氮源、维生素、矿物质等。物质等。 选择对照用菌液，供对照试验用。选择对照用菌液，供对照试验用。 具体检查，如接种、培养等操作。具体检查，如接种、培养等操作。 结果判断，得出阴性或阳性的结论。结果判断，得出阴性或阳性的结论。第37页/共64页2 2、注意事项：、注意事项： 无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作法，包括对操作环境、试

25、验材料及用具酶灭法，包括对操作环境、试验材料及用具酶灭菌等，防止微生物污染。菌等，防止微生物污染。 应避免在有抑菌条件下操作。应避免在有抑菌条件下操作。 从事无菌操作人员应具备微生物学的基础从事无菌操作人员应具备微生物学的基础知识及一定工作经验，否则要经过无菌技能知识及一定工作经验，否则要经过无菌技能的培训，方能从事此工作。的培训，方能从事此工作。第38页/共64页（六）基因工程药物中可能杂质与污染（六）基因工程药物中可能杂质与污染物检查物检查可能杂质：残留可能杂质：残留DNADNA、宿主细胞蛋白质、宿主细胞蛋白质、内毒素等；、内毒素等；主要污染物：微生物、热原、病毒等。主要污染物：微生物、热

26、原、病毒等。主要检查项目：外源性主要检查项目：外源性DNADNA、其他外源、其他外源性杂质测定性杂质测定第39页/共64页（七）致突变试验（七）致突变试验包括：微生物回复突变试验、哺乳动物包括：微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试验等。核试验等。（八）生殖毒性试验（八）生殖毒性试验包括：一般生殖毒性试验、围生期毒性包括：一般生殖毒性试验、围生期毒性试验。试验。第40页/共64页四、含量（效价）测定四、含量（效价）测定含含量量表表示示方方法法百分含量，适用于结构明确的小百分含量，适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子分子药物

27、或经水解后变成小分子的药物。的药物。生物效价或酶活力，适用于酶类生物效价或酶活力，适用于酶类、蛋白质类等药物。、蛋白质类等药物。 第41页/共64页（一）含量测定（一）含量测定1 1、HPLCHPLC法法2 2、SDS-PAGESDS-PAGE法法（二）效价测定：采用国际或国家参考（二）效价测定：采用国际或国家参考品，或经国家检定机构认可的参考品，品，或经国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法测定其生物学活性，并以体内或体外法测定其生物学活性，并标明其活性单位。标明其活性单位。第42页/共64页第三节第三节 常用定量分析方法及其应用常用定量分析方法及其应用一、理化法一、理化法（一）化学分析法

28、（一）化学分析法1 1、重量法：根据样品中分离出的单质、重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。或化合物的重量测定所含成分的含量。（1 1）提取法）提取法 （2 2）挥发法）挥发法 （3 3）沉淀法）沉淀法第43页/共64页（二）电化学分析法（二）电化学分析法 离子选择性电极：测量离子活度的离子选择性电极：测量离子活度的指示电极。指示电极。 2 2、滴定分析法：根据样品中某些成分、滴定分析法：根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生酸碱中和、与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定。氧化还原或络合反应等进行测定。第44页/共64页（三）光谱分析法（三

29、）光谱分析法1 1、比色法：样品与显色剂可发生颜色、比色法：样品与显色剂可发生颜色反应，依颜色反应的强度测定含量。反应，依颜色反应的强度测定含量。如如蛋白质蛋白质的含量测定，可利用蛋白质的含量测定，可利用蛋白质与与双缩脲试剂双缩脲试剂发生颜色反应，而进行发生颜色反应，而进行定量测定。定量测定。第45页/共64页2 2、UVUV法：样品或转化后的产物在某一波法：样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测定。如蛋白质在定。如蛋白质在280nm280nm左右有最大吸收左右有

30、最大吸收 。3 3、荧光分光光度法：根据物质被、荧光分光光度法：根据物质被UVUV光照光照射后产生的荧光强度进行定量测定。射后产生的荧光强度进行定量测定。第46页/共64页（四）色谱分析法（四）色谱分析法1 1、HPLCHPLC法法（1 1）RP-HPLCRP-HPLC法：适用于肽类、氨基酸法：适用于肽类、氨基酸、蛋白质和多糖的测定，如生白能。、蛋白质和多糖的测定，如生白能。固定相：固定相：C8C8、C18C18烷基硅烷键合相烷基硅烷键合相流动相：甲醇流动相：甲醇- -水、乙腈水、乙腈- -水（甲醇）、乙水（甲醇）、乙腈腈- -缓冲液缓冲液第47页/共64页（2 2）高效离子交换色谱法（）高效

31、离子交换色谱法（HPIECHPIEC） HPIEC HPIEC特点如下：特点如下： 蛋白质、多肽的分离是根据其相应的蛋白质、多肽的分离是根据其相应的离子化程度而进行的。离子化程度而进行的。 分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱法进行的法进行的 柱效中等并具较高质量的活性回收。柱效中等并具较高质量的活性回收。 第48页/共64页（3 3）高效凝胶过滤色谱法（）高效凝胶过滤色谱法（HPGFCHPGFC） HPGFC HPGFC特点如下：特点如下： 活性蛋白质可得以回收。活性蛋白质可得以回收。 分离是在固定比例的水溶液中进行分离是在固定比例的水溶液中进行的。的。 分离是根

32、据蛋白质或多肽在溶液中分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的。相应的有效粒径而进行的。第49页/共64页2 2、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCEHPCE） HPCE HPCE是根据带电组分在管中由于是根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小，即荷质其所带电荷和分子量的大小，即荷质比不同产生不同的迁移速度而分离。比不同产生不同的迁移速度而分离。第50页/共64页类类型型酶活力测定法酶活力测定法：以酶为分析对象，：以酶为分析对象，测定样品中某种酶的活力或活性，测定样品中某种酶的活力或活性，并用活力单位和比活性表示并用活力单位和比活性表示 。酶分析法酶分析法：以酶为

33、分析工具或分：以酶为分析工具或分析试剂，测定样品中酶以外的其析试剂，测定样品中酶以外的其它物质的含量。它物质的含量。二、酶法二、酶法第51页/共64页（一）酶活力测定法（一）酶活力测定法 1 1、定义：、定义： 酶活力酶活力是指酶催化一定化学反应的是指酶催化一定化学反应的能力。能力。酶活力的测定酶活力的测定实际上是测定一个实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的被酶所催化的化学反应的速度速度可以用可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。来表示。第52页/共64页2 2、方法、方法（1 1）终点法：在适当的条件下，把酶）终点法：在适当的条件下，把酶和底物混

34、合，测定生成一定量产物所和底物混合，测定生成一定量产物所需的时间。需的时间。 （2 2）将酶和底物混合后隔一定时间，）将酶和底物混合后隔一定时间，间断地或连续地测定反应的连续变化间断地或连续地测定反应的连续变化。第53页/共64页（3 3）将酶与底物混合后，让其反应一）将酶与底物混合后，让其反应一定时间，然后停止反应，定量测定底定时间，然后停止反应，定量测定底物减少或产物生成的量。物减少或产物生成的量。 第54页/共64页（二）酶分析法（二）酶分析法 1 1、动力学分析法：、动力学分析法： 通过条件控制，分别使通过条件控制，分别使底物、辅酶底物、辅酶活化剂或抑制剂活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中

35、起决的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用。则酶的反应速定反应速度的主导作用。则酶的反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，通过测定酶反应速度即可的比例关系，通过测定酶反应速度即可求出它们的浓度。求出它们的浓度。第55页/共64页2 2、总变量分析法（平衡法或终点法）、总变量分析法（平衡法或终点法）： 根据被测物质（底物）的性质，选根据被测物质（底物）的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，在反应完成后，借助理化方法测出其，在反应完成后，借助理化方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，计算总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度。出被测物的实际含量或浓度。第56页/共64页三、电泳法三、电泳法 （一）基本原理（一）基本原理 电泳法电泳法是指带电微粒如蛋白质、核是指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速用下，向其对应的电极方向按各自的速度泳动而使组分分离，再进行检测或计度泳动而使组分分离，再进行检测或计算百分含量的方法。算百分含量的方法。第57页/共64页（二）电泳法的分类（二）电泳法的分类1 1、自由界面电