生物技术与人类健康

1、9 生物技术与人类健康学习目的 :认识医学领域是现代生物技术应用最广泛、 成绩最显著、 发展最迅速的领 域。了解生物技术对疫苗生产、疾病诊断、生物制药等领域的影响。了解生物技术对人 类健康、延长人类寿命、提高生活质量所具有的不可估量的作目前,医药卫生领域是现代生物技术应用得最广泛、成绩最显著、发展最迅速、潜力也 最大的一个领域。据统计,目前生物技术的实际应用约 60%是在医药卫生方面。这是因为 生物技术可以在许多方面改进医药的生产、 开发新的药品资源、 改善医疗手段, 从而提高整 个医疗水平。 它可以提供过去常规方法不能生产的药品或制剂; 替代化学合成法或组织提取 法等生产成本昂贵的药品生产技

2、术; 提供灵敏度高、 反应专一、 实用性强的临床诊断新试剂 和新方法;提供安全性能好、免疫能力强的新一代疫苗。所以生物技术是提高生命质量、延 长人类寿命的重要技术手段。生物技术在医药卫生领域的主要产品包括:疾病预防的疫苗、 疾病诊断的单克隆抗体及基因探针、疾病治疗的生物药品及其他一些新的治疗手段。9. 1 生物技术与疫苗9, 1. 1 疫苗概说利用疫苗对人体进行主动免疫是预防传染性疾病的最有效手段之一。 它可以在接受疫苗 者的体内建立起对入侵物质感染的免疫抗性,从而保护疫苗接受者免受相应病原体的侵染。 注射或口服疫苗可以激活体内免疫系统, 产生相应的抗病原体的抗体。 这样, 如果以后再遇 到相

3、应的侵入,那么免疫系统仍会被激活,使入侵的病原体被中和失活或致死而排出体外, 使致病性降低或消失。 目前已有几十种用于人类主要传染性疾病的疫苗 (表 9 1 。 在我国的 儿童免疫已有七种疫苗列入计划免疫 (卡介苗、小儿麻痹、百白破、麻疹、乙型肝炎、乙型 脑炎、流行性脑炎 ,由国家免费提供疫苗,另有部分疫苗为自费疫苗。这些疫苗的使用为 人类控制传染性疾病起到了重大的作用。人类利用疫苗预防传染病可追朔到公元 10世纪,在宋朝的真宗时代,我国就有了接种 人痘预防天花的记载。到了明代则已广泛种植痘苗。 1796年英国医生 Jenner在总结前人发 现的基础上发现牛痘也可感染人, 但症状轻微, 被牛痘

4、感染的人可终身获得对天花的免疫能 力。 所以他开始改用更为安全的牛痘代替人痘接种。 由于技术的进步, 以及世界各国人民的 共同努力, 1980年 5月,第三十三届世界卫生大会庄严宣告全世界已消灭天花。这是人类 利用疫苗战胜烈性传染病的一项伟大壮举。 19世纪中叶,法国科学家巴斯德首先发明了细菌的纯种培养技术及减毒疫苗的制备技 术,并首先用于牛、羊的炭疽病预防。 1885年 6月,巴斯德用它制备的狂犬疫苗挽救了一个被疯狗咬伤的男孩的生命。 这是减毒疫苗首次应用于人类。 之后, 利用巴斯德建立的减毒、 弱化或灭活病原体做疫苗的技术, 科学家们发明了许许多多的人用传染病疫苗, 有的还一直 延用至今,

5、如百日咳杆菌疫苗、白喉杆菌疫苗、破伤风杆菌疫苗、结核杆菌疫苗 (卡介苗 、 脑膜炎双球菌疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、乙型脑炎病毒疫苗等。这类用病 原体减毒或弱化的疫苗称为第一代疫苗。第一代疫苗的使用, 对人们预防传染病的传播做出了不可磨灭的贡献, 但第一代疫苗在 生产和使用中具有不安全性及对某些传染病使用效果不甚理想。 所谓的不安全性是指疫苗生 产过程中必须大量繁殖病原体, 对工作人员是个严重的威胁; 并且在使用中偶见因减毒或灭 活不彻底而导致被免疫者被感染的报道。 因此, 科学家们一直在寻找更安全、 更有效的新一 代疫苗。 20世纪 70年代之后,由于基因工程技术的发展,人们开始

6、利用基因工程技术来生 产疫苗。 基因工程疫苗在生产和使用上是安全的。 这是因为基因工程疫苗是将病原体的抗原 (某种蛋白质 基因克隆在细菌或真核细胞内,利用细菌或细胞生产病原体的抗原。利用这种 抗原而不是病原体本身作为疫苗, 所以它是安全的。 人们还可以利用基因工程技术, 将同一 病原体的不同抗原决定簇, 重组在一个基因上以表达含不同抗原决定簇的多表位抗原, 从而 提高免疫效果; 还可以将不同病原体的抗原克隆于同一工程菌或工程细胞, 以表达不同病原 体的抗原,制备成所谓的多价疫苗。基因工程疫苗被称为第二代疫苗。1990年, Wolff 首先报道了小鼠肌肉注射质粒 DNA ,质粒及其所携带的基因可

7、以被细胞 摄取并表达。此后,关于核酸疫苗 (DNA疫苗、基因疫苗 在多个领域迅速地开展起来。所 谓的核酸疫苗是指将含有编码目的蛋白质基因序列的质粒载体, 经肌肉注射或微弹轰击等方 法导人体内, 通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白, 诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目的。 这种疫苗兼有基因工程疫苗的安全性和减毒活疫苗激发机体 强免疫反应的双重性,且免疫效果持久、制备简便、省时价廉等优点,短短几年内已获得了 可喜的成果并展示了诱人的前景。这种疫苗称为第三代疫苗。下面主要讨论第二代及第三代疫苗。9. 1。 2 病毒性疾病的疫苗9. 1. 2. 1 肝炎病毒疫苗病毒性肝炎是目

8、前世界上广为流行的传染病之一。 已发现的肝炎病毒已达六种, 分别用甲、 乙、 丙、 丁、 戊、 庚命名。 还有另外两种分别用己、 辛命名的病毒 (也称输血传播病毒, transfusion transmitted virus, TTV , 尚不能最终确定是否与肝炎有关。 估计全世界肝炎病毒携带者多达 5亿人。每年新患者达 5000多万人。其中又以乙型肝炎为最,携带者估计达 2亿人。乙肝 病毒携带者有可能转变成慢性肝炎,慢性肝炎病毒携带者的肝癌发生率是非携带者的 100倍,在全世界范围内约有 60%以上的肝癌发病与乙肝有关。由于乙型肝炎 (hepatitisB的猖獗和严重危害, 因而世界各国均将

9、乙型肝炎的监测和预防 作为医学研究的重点。 1982年,乙肝疫苗首次在美国面市,但由于当时生产的乙肝疫苗是 从人携带者的血液中分离出的病毒经灭活后作为疫苗, 因而受到血液来源和技术的限制。 制 成的疫苗数量少、价格昂贵、难于推广。并且由于是血源制品,安全上没有保障。为避免受 艾滋病病毒的污染, 有些国家已禁止使用乙肝血源性疫苗。 为此, 科学家们将眼光瞄准了基 因工程疫苗。1980年 5月,法国科学家首先用基因工程方法,在细菌和小鼠细胞中诱导产生乙肝病 毒的蛋白质,并且证明该蛋白质具有免疫原性。 1981年 Edman 等成功地克隆了乙肝表面抗 原 (HBsAg基因并获得大量的表面抗原。 19

10、86年美国 FDA 首先批准了 Merck 公司基因工程 乙肝疫苗 (酵母表达系统 上市。日本、英国和以色列等国的基因工程乙肝疫苗也很快地陆续 上市。 目前用基因工程生产乙肝疫苗主要有两种方法。 一是美国和日本等国家采用的, 将重组 DNA 导人酵母菌,由酵母菌产生乙肝抗原而制成的疫苗;另一是以色列等国家采用的, 将重组 DNA 导人仓鼠细胞,由仓鼠细胞生产疫苗。乙肝病毒的 DNA 疫苗也已进人临床观 察。我国在乙肝疫苗研究和生产上同样取得了令人瞩目的成果。 我国乙型肝炎感染情况相当 严重,全国无症状携带者约占抽样总人口的 1/10,约有 1000万人为慢性乙肝病毒携带者, 每年新发现的乙肝患

11、者约占总人口的 0. 7%。由于乙肝病毒又是慢性肝炎、肝硬化、肝癌 的病因之一,在已知的肝癌致癌因素中仅次于烟草。我国每年有 10多万人死于肝癌,占世 界肝癌死亡总数的 40%。乙肝传染途径主要通过阳性血源污染及母婴传播。为了有效控制 乙肝的传播,最有效的方法之一是阻断医院内的血源传播,更重要的是给每年约 1200万新 生儿接种疫苗,以阻断母婴传播。在台湾省的一项 10年研究结果表明,肝炎疫苗的使用已 经使儿童中的病毒携带者从 10%下降到 1%。 研究者们希望这一巨大改变也将导致儿童中肝 癌发病率的下降。 目前我国已在城市新生儿中开展此项免疫计划。 然而要彻底消灭乙肝则需 要 4050年坚持

12、不懈的努力。我国在第六个五年计划期间, 经科学家们的努力, 已有血源疫苗供应, 并使乙肝感染得 到了初步的控制。 目前我国生产的基因工程疫苗, 主要采用酵母表达系统表达乙肝表面抗原 作为疫苗,同时也建立了哺乳动物细胞的高效表达系统。由于乙肝在我国的感染人群很大, 要消灭乙肝,需要更经济,更有效的新型乙肝疫苗。由于人群中约有 10%的人对现有乙肝 疫苗无反应, 因此目前国际、 国内都在致力于开发新一代乙肝疫苗。 如带有 preS l 片段和 preS 2片段的表面抗原研究,高效表达系统研究,构建表面抗原与核心抗原 (HBoAs的融合抗原, 新型免疫佐剂的开发等。甲型肝炎和丙型肝炎是两种经由消化道

13、传染的流行较广的病毒性肝炎。 国外已有甲型肝 炎病毒灭活疫苗面市。我国使用的减毒疫苗也取得了很好的效果。国内基因工程空壳 (不带 病毒的遗传物质 甲肝病毒及痘苗活病毒疫苗 (将甲肝病毒的抗原基因插入到减毒的牛痘病 毒基因组中,构建重组病毒,经它感染可不断分泌甲肝抗原,达到长期免疫的目的 也显示 了很好的免疫原性。丙型肝炎病毒感染后,大部分病人转为慢性肝炎,其中部分病人可发展为肝硬化甚至 肝癌。目前尚无特效治疗药物或预防方法,对感染者的危害远大于乙肝病毒感染。因此,研 制一种高效、安全、价廉的丙肝疫苗,是目前世界各国科学家们面临的当务之急。但由于丙 型肝炎病毒目前尚未能培养成功。 而且丙肝病毒还

14、存在着高突变率, 尤其是包膜区的多变性, 目前已知至少存在 6种不同基因型的病毒,各型之间的异源性高达 25%30%,给丙肝疫 苗的研究带来了重重困难。 这也是为什么至今仍未见有丙肝疫苗上市的原因之一。 核酸疫苗 概念的提出,给丙肝疫苗研制带来了希望。 1996年 Tokushige 等用丙肝病毒 C 区基因构建 成重组 DNA, 免疫 15只小鼠并检测到了相应的抗丙肝抗体,还可诱导产生细胞免疫反应。 我国浙江医科大学传染病研究所同样证实核酸疫苗可诱发小鼠产生细胞免疫反应及体液免 疫反应。尽管如此,丙肝核酸疫苗的研究仍有许多问题有待解决。9. 1. 2. 2艾滋病病毒疫苗艾滋病 (全称为人类获

15、得性免疫缺陷综合征, acquired immune deficiency syndrome, AIDS 是由人类免疫缺陷病毒 (HIV的感染引起的。由于艾滋病的迅速蔓延,已给人类的健康带来 了极大的威胁。在艾滋病发现的二十多年来,已使 6000多万人感染,患者人数已达 4000多万,死亡人数达 2000多万。根据卫生部 2002年的估计,我国被感染者估计已达 100万 人, 如不采取有效措施, 到 2010年我国的感染人数将达 1000万, 从而引起人们对艾滋病的 极大关注。专家们认为,从长远的观点来看,疫苗是对付艾滋病的最好办法。艾滋病疫苗的 研究也是目前国际上基因工程疫苗研究投入最大的项

16、目。艾滋病疫苗的研究主要是以病毒外膜蛋白和 gpl60、 gpl20基因克隆后在不同的表达系统中表达。目前已有约 40多种的艾滋病疫苗正在研究之中,但由于艾滋病病毒与丙肝病毒 相类似,具有多型善变的特点,因此对艾滋病疫苗的研究并不顺利。到了 1998年之前,所 有艾滋病疫苗还一直处于动物实验阶段。 如法国科学家用 g'p120/氢氧化铝佐剂免疫两只黑 猩猩后, 连续进行了 100次人工接种艾滋病病毒, 7个月后两只黑猩猩仍未被病毒感染。 1998年初美国 FDA 批准了第一个艾滋病疫苗进入人体试验, 同意美国基因疫苗公司于 1999年在 7500名健康志愿者身上试验他们研究的 HIV

17、疫苗,该疫苗的主要成分是 gp20。几个月之 后, FDA 又批准了 VaxGen 公司将其研制的艾滋病疫苗投入大规模的人体试验, 2002年 7月在巴塞罗那召开的国际艾滋病大会上, 该公司的代表表示, 他们可能在 5年内正式推出艾 滋病预防性疫苗。在泰国也曾经进行数千人规模的使用 gpl20亚单位疫苗的临床试验,但结 果发现保护效果不明显。 科学家们正在研究多亚型 (目前国际上流行的有 A 、 B 、 C 三个亚型 、 多抗原 (如 env 、 gap 、 pl 、 nef 的基因工程疫苗及多抗原的 DNA疫苗。 目前国际上包括 DNA 疫苗在内的大约有 20多种疫苗在进行着临床试验,其中大

18、部分仍然处于初级阶段,只有 8种进入较大规模的临床试验,但还没有一种疫苗能进入实用阶段。我国同样非常重视对艾滋病疫苗的研究。我国艾滋病疫苗的研究采用复合病毒颗粒的 方法而不是采用单一蛋白质的方法, 借用与艾滋病同属慢性病的马传染性贫血病毒疫苗和消 灭天花的牛痘疫苗的原理研究艾滋病疫苗。 2002年底已完成动物试验,将用 11.5年的时 间进行 I 期临床试验以观察其安全性。随后进入、期临床试验以观察疫苗的保护效果, 预计 2006年左右完成全部临床试验。9. 1. 2. 3 其他病毒性疾病疫苗小儿麻痹症是由脊髓灰质炎病毒引起的中枢神经系统疾病。 据世界卫生组织报道, 发达 国家由于使用疫苗,

19、小儿麻痹症已能得到很好的控制, 但在发展中国家、 仍然是对公众健康 的主要威胁。 在进行有效接种计划的国家中, 虽然小儿麻痹症的病例很少, 但偶尔仍有几例 使用减毒疫苗引起小儿麻痹症的报道。 所以开发更安全的疫苗仍具有实际意义。 经研究发现, 脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白 VP 1、 VP 2和 VP 3, 在实验动物身上能诱导产生相应的中和抗体,使 其获得对病毒的免疫能力, 并已制成了注射用的小儿麻痹疫苗。 在日本, 则通过基因工程方 法改变脊髓灰质炎病毒的基因结构, 获得了一个弱化了的脊髓灰质炎病毒, 用它研制成了小 儿麻痹口服疫苗。狂犬病是一种由狂犬病毒引起的中枢神经系统急性传染病。目前狂犬病

20、仍在全世界 87个国家和地区流行, 估计每年因狂犬病而死亡者达 35000人。 狂犬病疫苗是继天花之后, 人 类最早应用的第二个疫苗。由于狂犬病死亡率为 100%,促使人们对狂犬病疫苗的制备和使 用进行了大量的研究。 狂犬病疫苗经历了脑组织细胞培养、 基因工程、 合成肽及抗独特型抗 体疫苗等几个发展阶段。 由于脑组织疫苗可引起严重的神经系统副作用, 目前已大多停止使 用。 细胞培养疫苗具有良好的抗原性、 副作用少, 所以在控制人类狂犬病方面发挥着重要的 作用。 为了克服减毒疫苗的潜在危险, 曾使用基因工程方法在大肠杆菌、 酵母菌及哺乳动物 细胞中表达狂犬病毒糖蛋白, 但由于免疫性较差、 产量较

21、低, 最后转而采用狂犬病毒痘苗 活疫苗重组病毒作为疫苗, 最近又发展了动物实验效果较好且更为安全的金丝雀痘病毒活疫 苗。EB(Epstein-Barr病毒是 5种疱疹病毒之一,在非洲,这种病毒主要侵染 B 淋巴细胞引 起伯基特 (Burkitt s 淋巴瘤,在地中海地区及包括我国在内的亚洲地区则主要侵染口、咽上 皮细胞引起鼻咽癌。现在已成功地构建 EB 病毒膜抗原的重组痘苗病毒,以及中国仓鼠表达 系统,并完成了成人、儿童和幼儿的免疫观察。引起流行性感冒的流感病毒在世界范围内广泛地流行。由于流感病毒与丙肝病毒类似, 极易发生变异, 其包膜蛋白的快变性使得流感病毒能逃避中和抗体的作用, 因而出现流

22、感的 周期性大流行, 所以流感病毒一直未能有有效的疫苗面市。 1993年 Ulmer 首先使用核酸疫苗免疫小鼠并取得了令人满意的效果。他将流感病毒高度保守的 NP 基因插入质粒中,注射 BALB /C 小鼠肌肉,可诱发小鼠对流感病毒产生体液免疫反应和细胞免疫反应。 1996年 Pertmer 则采用基因枪的方法将流感病毒 DNA 疫苗导人小鼠,发现其效果比注射法更好。 除此之外, 目前正在研制或已上市的基因工程病毒性疾病疫苗还有:疱疹病毒疫苗、 流 行性出血热病毒疫苗、风疹病毒疫苗、轮状病毒疫苗等 (表 9-2 。 合在一起, 产生一种带有多种病原体抗原决定簇的融合蛋白, 或将多种病原体相关抗

23、原克隆在同一个载体 (多价表达载体 上,达到同时对多种相关疾病同时免疫的目的。美国于 1986年 10月首先研制了一种含有疱疹病毒、肝炎病毒和流感病毒的疫苗。 .法国科学家则将脊髓灰质炎病毒外壳蛋白基因和乙肝病毒表面抗原基因融合在一起, 由哺乳动物细胞表达而制成疫苗。我国已构建了完整的痘苗病毒天坛株多价载体表达系统, 并表达了乙肝病毒表面抗原基因和白细胞介素 2、麻疹病毒和白细胞介素 2等。9. 1。 3 细菌性疾病的疫苗由于细菌和其他病原体的表面结构相对病毒而言比较复杂并处于动态状态,所以在大 多数情况下这种性质不利于基因工程疫苗的开发。 并且细菌感染在大多数情况下可用抗生素 控制,因此目前

24、使用的细菌基因工程疫苗没有病毒疫苗广泛。9. 1. 3. 1 霍乱弧菌疫苗霍乱是由霍乱弧菌感染而引起的烈性肠道传染病。从 1917年起,世界上有记 ' 载的霍 乱大流行就有 7次。据世界卫生组织报道,有 35个国家受到第 7次 (19841985 霍乱流行 的影响。仅 1984年,就有 19个非洲国家受其影响,例如马里共和 国在 1985年 I 7月就 有 500多人死于霍乱。霍乱不是一种侵袭性感染, 病菌不进入血液, 只局限在肠道内, 但它在肠道内 繁殖并 释放毒素。霍乱弧菌分泌的肠毒素是一种不耐热的原型肠毒素。该毒素由 A 和 B 两个亚单 位组成, A 亚单位刺激腺苷酸环化酶,产

25、生 cAMP 并在小肠黏膜细胞内积累,导致大量水 和电解质排出,引起剧烈腹泻,导致严重脱水、酸中毒而死亡。 B 亚单位则能促使 A 亚单 位进入细胞。 A 亚单位和 B 亚单位均能诱导机体产 生中和抗体。根据霍乱弧菌的致病机制, 科学家们设想如果能改造霍乱弧菌的基因结构, 使 编码 A 亚单位的基因突变,不能产生 A 亚单位,但保留 B 亚单位的基因,细菌能继 续产生 B 亚 单位。那么这种细菌将是一种不会致病但仍保留免疫原性的细菌了。美国哈佛大学 Mekalanos 等通过诱变缺失的方法, 获得了 A 亚单位缺失的 0595 品系, 以此制成了减毒疫苗。马里兰大学的 Ledne 等则利用基因

26、工程的方法,克隆了 A 亚单位基因,然后 将 A 亚 单位基因切去 94%,而将编码抗氨苄青霉素的基因取而代之。这种改造了 的基因导人霍 乱弧菌,利用同源重组使改造后的基因替代霍乱弧菌的 A 亚单位基因。这种基因工程改造 后的细菌同样不能释放 A 亚单位,但保持免疫活性。我国则利用基因工程方法克隆了 B 亚单位基因,构建了 B 亚单位的基因工程菌并获得 了高效表达。将 B 亚单位 (rBS与灭活菌苗 WC 组成复合疫苗。临床试验结果表明, 此疫苗无明显副作用, 且诱导免疫系统产生抗体的能力与国际同规模的试验结 果一致。 我国科学家们还将霍乱弧菌的抗原或灭活菌苗与伤寒沙门氏菌的菌苗组合成多价疫

27、苗,也获得了令人满意的效果。9. 1. 3. 2麻风杆菌疫苗麻风是由麻风分枝杆菌引起的慢性传染病。 这是 1873年由 Hansen 最早确定的人类第一 个致病菌。 但由于这种细菌仍然未能在体外培养, 因而严重地阻碍了对麻风病的诊断、 免疫 学和治疗学方面的研究,也严重地阻碍了疫苗的开发。1976年,人们发现犰狳是除了人之外惟一可以让麻风杆菌自由增殖的动物。使麻风疫 苗的研制成为可能。之后,从 20世纪 70年代中期至 80年代中期,人们对麻风减毒疫苗进 行了许多研究,并在人及犰狳中进行了对比接种观察,发现麻风疫苗与卡介苗 (一种常用的 结核病疫苗 联合使用效果更佳。这种疫苗既可以预防健康者受

28、麻风杆菌的感染,也可以控 制或减轻已被感染者的病情发展和病型的恶性转化。 但是应该指出, 由于麻风病的潜伏期特 别长, 可达 525年, 一种有效的疫苗对一位可检查出来的麻风结节病患者的抑制只有十几年。也就是说,大约 10-15年才能看出抗麻风结节疫苗的预防效果。在第一代麻风疫苗研究开始一年之后, Curtiss 和 Shepard 就提出过设想:利用基因工程 的方法生产合适有效的麻风疫苗。 美国 Young 和 Whitehead 生物医学研究所和麻省理工学院 生物学系等单位合作,将麻风杆菌的 DNA 片段重组到大肠杆菌的半乳糖苷酶基因上, 将这种融合基因再重组到 gtll 载体中,由此获得

29、了-半乳糖苷酶和麻风杆菌基因编码的蛋 白质的融合蛋白。 Bloom 等则将麻风杆菌的基因克隆到活的卡介苗中制备成多价疫苗。 通过基因工程技术制备的麻风疫苗可以作为抗原,还可以用来发展特异血清流行病检 查。这种检查可以诊断早期麻风感染。因此,可以在第一临床症状出现之前进行检查,从而 进行早期治疗,并能预防神经系统的进一步损伤和畸形的恶化。9. 1. 3. 3 幽门螺杆菌 (HP疫苗自从 Warren 等 (1983首次分离成功 HP 以来,大量的研究结果证实 ItP 是慢性胃炎和消 化道溃疡的主要病原体。由于慢性胃炎可发展为黏膜萎缩、异型增生,最终导致胃癌,故世 界卫生组织 (WHO将之列为 I

30、 级生物致癌原。一些资料表明人类 HP 的感染可达 40%60 %,故 Hp 疫苗的研究在上述疾病的防治上具有重要的意义。幽门螺杆菌的灭活全细胞或经超声波破碎后的无细胞提取物均具有一定的免疫原性。 实 验证明它们都可以作为疫苗保护机体免受 HP 的攻击。 但由于 HP 大量培养仍有一定的难度, 所以发展为普及型疫苗仍有困难。 1995年 Lee 等报道用HP 的尿素酶及大肠杆菌不耐热肠毒素为佐剂免疫小鼠,可产生保护性抗体,但由于尿素酶 是 HP 的一种重要胞外酶,它的作用是分解尿素产生氨,使局部 pH 升高,以利于 HP 的生 长,所以这种免疫并不能直接杀灭幽门螺杆菌。 Hp 的尿素酶疫苗在瑞

31、士已进入期临床观 察。在基因工程细菌病疫苗研究与应用方面,还有致腹泻大肠杆菌疫苗、痢疾疫苗、鼠伤 寒沙门氏菌疫苗、淋球菌疫苗、脑膜炎双球菌疫苗等 (表 9-2 。9. 1. 4寄生虫病疫苗9. 1. 4. 1 疟原虫疫苗疟原虫是引起疟疾的一种寄生虫。 疟疾是一种广泛传播的人类寄生虫病。 据世界卫生组 织估计,亚热带地区至少有 3. 5亿人受疟疾的折磨,而整个世界则达 8亿人,每年有 1. 5亿例发生。在非洲每年有刃多万 1岁以下儿童因患疟疾而死亡, 5岁以下儿童的死亡人数则 达每年 100万。引起人类疟疾的有四种疟原虫:恶性疟原虫, 它是由疟疾引起死亡的病因; 间日疟原虫, 传播范围也不小,发

32、病率很高;而三日疟原虫和卵形疟原虫则流行较少。由于疟原虫及其传播媒介蚊子的抗药性的获得,使得其疫苗的研究更显其重要性。目 前疟原虫的基因工程疫苗有抗子孢子疫苗,如 CSP 蛋白质;抗裂殖子疫苗;抗配子母细胞 疫苗等。9. 1. 4. 2血吸虫疫苗血吸虫是引起血吸虫病的病原体。 该病是一种严重威胁人类健康的慢性消耗性疾病, 流 行于亚洲、 非洲和拉丁美洲的 75个国家。 世界上约有 56亿人口受到此病影响。 尽管吡喹 酮的疗效及安全性较好,但除非长期重复用药,否则难于控制再感染的发生。在 1991年世 界卫生组织召开的血吸虫病疫苗研究策略研讨会上, 与会者一致认为血吸虫病疫苗的研究是 必要的、可

33、行的。感染人类的血吸虫主要有三种, 即埃及血吸虫、 曼氏血吸虫及日本血吸虫。 血吸虫基因 工程疫苗主要有两大类:一类是虫体蛋白质,如 28kDa 蛋白和 25kDa 蛋白的基因工程疫苗 就具有良好的抗原性;另一类是酶性抗原,如谷胱甘肽 S-巯基转移酶 (GST、 3磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH、超氧化物歧化酶 (SOD、磷酸葡萄糖同分异构酶 (TPl等侯选抗原。 寄生虫的 DNA 疫苗也是 20世纪 90年代之后寄生虫疫苗研究的一个主要方向, 目前正 在研究的有吸血虫、疟原虫、利什曼原虫、小隐孢子虫等寄生虫 DNA 疫苗。9. 1. 5 DNA疫苗DNA 疫苗是利用克隆于载体上的抗原基因直接

34、注射机体,被细胞摄取并在细胞内表达 相应的抗原,通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。 DNA 疫苗的最大优点是易于制备、 便于保存、 基因在细胞的持续表达可达到持续免疫的效果并且易于制成多联多价疫苗, 也有 报道 DNA 疫苗可诱发细胞免疫,因此 DNA 疫苗是十年来疫苗研究技术最为显著的进展和 改良。然而, DNA 是否会整合到染色体上而引起严重的后果,是否会引起免疫病理作用, 如诱发自身抗核抗体,是否会产生免疫耐受等问题仍有待研究与观察。病毒性疾病方面目前只有艾滋病病毒、乙肝病毒的 DNA 疫苗处于临床观察阶段,但有 丙肝病毒、戊肝病毒、巨细胞病毒、单纯胞疹病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、

35、E-B 病毒、 麻疹病毒、 埃博拉病毒等多种病毒处于研究阶段。 细菌性疾病方面目前有破伤风杆菌、 伯氏 螺旋体、 分支结核杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 肺炎支原体等处于动物研究阶段。 寄生虫病方面, 疟原虫、利什曼原虫、血吸虫、弓型虫等寄生虫的 DNA疫苗也已处于研究阶段。9. 1. 6 避孕疫苗人口压力一直是影响发展中国家经济发展的重要因素之一。因此控制人口增长一直是 这些国家面临的问题。 除了国家制订的一系列法规政策之外, 避孕技术的进步和推广是有效 控制人口增长的重要技术手段。9. 1. 6. 1 精子避孕疫苗精子避孕疫苗早在 20世纪 30年代已开始研究, 但由于其结果的不肯定和出于伦理学

36、的 考虑而放弃。 20世纪 70年代之后才有计划、有系统地重新开展研究。所谓的精子避孕疫苗 就是利用精子的特异性蛋白质作为抗原, 免疫男性或女性, 诱发产生相应的中和抗体, 达到 减少精子的产生或阻断受精过程,从而达到避孕的目的。目前作为抗原用的精子特异蛋白质主要有乳酸脱氢酶 C-4、 SP-10、顶体蛋白、 FA-1、 AH-20和 PH-20等几种。这些蛋白质抗原都已进行了动物实验,如 PH-20抗原注射雌性豚 鼠,可使雌性豚鼠百分之一百产生不育,但 618个月后又可恢复育性。同时,利用基因工 程技术已成功地克隆了多个蛋白质基因, 但要获得与天然蛋白质结构相同并且具有高免疫活 性的重组蛋白

37、, 还有一些技术问题需要解决。 之后, 还将进一步研究哪些蛋白质抗原在灵长 类中最有效、副作用最小、最佳佐剂及最佳给药途径等一系列问题。9. 1. 6. 2激素类避孕疫苗精子和卵子的产生过程、 受精过程及妊娠过程需要多种激素的参与。 人们设想以这些激 素作为抗原, 免疫男性或女性以产生相应的中和抗体, 降低机体内相应的激素水平使得精子 或卵子不能产生或不能受精或不能怀孕,同样可以达到避孕的目的。目前进入临床试验的已有人绒毛膜促性腺激素 (HCG、促性腺激素释放激素 (GnRH和促卵泡激素 (FSH等。HCG 是由胎盘分泌的一种激素,起着维持妊娠、胎盘发育等功能,所以它是一种女性 用疫苗。 HC

38、G 由 a 亚单位和 -亚单位组成。由于 a 亚单位和促甲状腺激素、促卵泡激素 和黄体生成素的 a 亚单位相同,它们之间有相同的抗原性而不适合于作为疫苗使用。 -亚单 位有独特的结构和功能, 所以 HCG-亚单位可作为疫苗。 目前的 HCG 疫苗制品有两种形式, 一种是以完整的 亚单位作为疫苗 (HCG疫苗 ,另一种是含有 37个氨基酸的 -亚单位羧 基末端肽 (HCC,-CTP 疫苗 。GnRH 是由下丘脑分泌的、起着调节促性腺激素释放的特殊功能。在男性, GnRH水 平下降会抑制甾体化合物的合成和精子的产生, 在女性则会引起排卵抑制。 所以它可能成为 男性或女性共用的一种疫苗。印度首先研制

39、了 GnRH 疫苗。这种疫苗用于男性时使促卵泡 激素、 黄体生成素以及睾丸酮水平明显下降, 导致精子数量下降。 由于考虑到睾丸酮是维持 男性化必需的激素, 所以 GnRH 用于男性, 需用睾丸酮替代治疗。 GnRH 也提倡用于产后的 妇女,以延长哺乳期无月经的不排卵期。FSH 是由脑垂体分泌的一种激素。这种激素在女性可促进卵泡生长,在男性则可促进 精子生成,所以这种疫苗可望用于控制男性的生育能力。用纯化的绵羊 FSH免疫灵长类动 物帽猴,结果显示被免疫的猴子健康,有性活动能力,睾丸酮水平不受影响,但转为少精或 无精症并失去生育能力。 受试 5年后的猴子并不显示任何不利于健康的副作用。 这种疫苗

40、已 于 1995年在印度进入了 I 期临床检验,这是第一个试用于人类的男性避孕疫苗。9. 2 生物技术与疾病诊断现代生物技术的开发应用, 为医疗卫生领域提供了崭新的诊断、 监测技术。 人们对疾病, 特别是传染病的诊断, 一个很重要的问题就是如何尽早检测感染性因子的种类, 因为它对疾 病的针对性治疗及其预后有着极其重要的意义。 传统的传染病诊断技术, 一是根据临床症状 判断, 但这必须被感染者发病, 有了临床症状才可进行诊断, 况且有些疾病其临床表现非常 相似,不具有典型症状,有时难于判断;二是先对病原物质进行分离培养,对培养物进行一 系列的生理生化检测,从而确定病原体的种类,但这种方法需要花费

41、较多的时间,成本高、 速度慢、 效率低, 况且有些如病毒类、 衣原体类的病原体至今仍没有有效的体外培养方法从 而影响了疾病的诊断。 所以利用现代生物技术发展快速、 灵敏、 操作简便的新的诊断技术在 疾病防治上具有积极的意义。9. 2. 1 ELISA技术与单克隆抗体9. 2. 1. 1 ELISA技术的原理ELISA 技术称为酶联免疫吸附检测技术。 1971年瑞典的 Engvall 等人分别以纤维素和聚 苯乙烯试管作为固相载体吸附抗原或抗体,结合酶技术建立了酶联免疫吸附检测法 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA 。 1974年 V oller 等

42、又将固相支持物改为聚苯乙烯微量反 应板,使 ELISA 技术得以推广应用。El,ISA 法是酶免疫检测 (EIA的一种,其原理是将酶与抗体 (原 交联形成酶抗体 (原 复合物,常用的酶有辣根过氧化物酶 (HRP、碱性磷酸酯酶 (AP或脲酶等。 ,另外将抗原或 抗体吸附在以聚苯乙烯制成的微孔滴定板上, 使之固相化, 免疫反应和酶促反应均在其中进 行。 利用抗原与抗体的特异结合及酶将无色底物催化成有色底物, 并根据在一定范围内, 酶 量与颜色呈正相关的关系进行检测。 根据底物颜色的有无及颜色的深浅判断阴性或阳性反应 及反应强度,所以可以用于定性9. 2. 1. 2常用 ELISA 诊断技术目前常用

43、于检测抗原或抗体的 ELISA 法有以下两种:(1测定抗体的间接 ELISA 法 病原体或其他外源大分子物质进入机体后都可能刺激 机体产生相应的抗体, 所以可以通过检测某种病原体的相应抗体来判断机体是否曾经被某种 病原体所感染,达到诊断的目的。该方法首先将已知定量的抗原 (如某个病原体的蛋白质 吸附 (也称包被 在微孔滴定板的 微孔内,加入待检测的样品,如病人血清,反应一定时间。此时,如血清中有该病原体蛋白 质的抗体, 将被吸附在微孔板上。 洗涤以去除未结合的蛋白质 (抗原 。 加入酶标抗抗体 (如血 清为人血清,则加入抗人抗体的抗体 ,同样保温、洗涤后加入五色的酶底物,保温一定时间进行酶促反

44、应, 观察反应后颜色的有无及深浅来判断反应结果。 若有颜色反应, 说明检测 样品中含有相应的抗体,所以是阳性反应。根据颜色深浅,还可进行定量分析。反之,若为 无色,说明样品中无相应抗体,为阴性反应 (图 9-1(a。(2测定抗原的双抗体夹心法 病原体及其大分子物质进入机体后都可能成为一种抗 原,所以检测机体内的抗原同样可以判断机体是否感染了相应的病原体。该方法是将抗原免疫第一种动物 (如兔子、小鼠、山羊、绵羊或豚鼠中的一种 获得第一 种抗体。将第一种抗体吸附在微孔板上,加入待测样品 (如人的血清或其他 经保温反应后洗 涤。 如果待测样品中含有相应的抗原, 则该抗原将被吸附在抗体上从而保留在微孔

45、板上。 加 入用相同抗原免疫另一种动物产生的抗体 (第二种抗体 ,同样的保温洗涤后,第二个抗体也 将与抗原结合而保留在微孔板上。最后加入抗第二种抗体的酶标抗体,保温、洗涤后,将使 酶标抗抗体也结合在微孔板上。加底物显色后判定反应结果。判定方法同上 (图 9-1(b。 图 9-1 ElISA原理示意图(引自张龙翔等, 19979. 2. 1. 3 基因工程抗原根据上述常用 ElISA 技术的原理,我们知道 ELISA 检验必须首先制备大量的抗原,如 用间接 ELISA 法测定抗体, 首先需要制备抗原并将之包被于微孔板上, 才可用来检测抗体; 如用双抗体夹心法检测抗原, 则必须首先要用抗原免疫动物

46、制备第一及第二抗体, 也才可以 用来检测抗原。所以抗原制备是 ELISA 技术的一个关键问题。传统的抗原制备方法一般有 两种,一是体外培养病原体,再将病原体收集,经一系列处理后制成;二是对于不能进行体 外培养的病原体, 只能从受感染的动物或病人的组织分离收集病原体, 再经一系列的处理后 制成。这两种方法存在着一些明显的缺点。首先,抗原生产过程本身就有很大的危险,因为 制造抗原时,要大量培养病原体,如果这些病原体逸出,将会造成很大危害;其次,产品的 质量难以控制,难以标准化,从而导致各批次产品质量的差异;再次,生产费用高,特别是那些体外不能培养的病原体更是如此。利用基因工程技术可以克服上述的不足

47、。 如疫苗生产一样, 将抗原基因克隆在细菌或真 核细胞表达系统中, 由这些表达系统生产大量的抗原。 生产过程不必接触病原体, 也便于标 准化生产,成本低廉。必要时,还可利用基因工程技术,将编码不同抗原决定簇的 DNA 片 段重组在一起构成一种带有多个强抗原决定簇的抗原,以提高其抗原性。9. 2. 1. 4 多克隆抗体与单克隆抗体EUSA 技术除了要制备抗原检测抗体外,有时还必须制备抗体,用于检测抗原。抗体的 制备可以将上述制备的抗原直接免疫动物,在被免疫的动物的血清中将会含有相应的抗体, 通过一系列的纯化技术就可获得相应的抗体。 但由于一个抗原往往会有多个抗原决定簇, 所 以由此方法制备的抗体

48、是一种含有可分别与多个抗原决定簇结合的多种抗体的混合物, 这种 混合物称之为多克隆抗体。 利用多克隆抗体进行疾病的诊断, 至少有几方面的缺点:特异 性较低, 这是由于不同的病原体之间可能会有相似的抗原决定簇, 这种多克隆抗体, 将会与 不同的病原体产生的抗原进行反应, 所以其假阳性率较高; 产品质量难于控制, 这是因为 被免疫的动物的个体差异, 同种抗原免疫后, 其产生的分别识别不同抗原决定簇的抗体的含 量会有不同,而且各批次的抗体之间也会有差异;生产过程费时、步骤多、成本高。 单克隆抗体是利用细胞融合技术, 在体外大量培养融合细胞, 由融合细胞产生大量的抗 体 (见 3. 3. 3 。由于单

49、克隆抗体只识别某一特定的抗原决定簇,所以它具有特异性强、成 分均一、灵敏度高、产量大、容易标准化生产等优点而明显优于多克隆抗体。目前世界上已 建立的单克隆抗体品种数以万计,其中数千种已经上市。单克隆抗体虽然主要用于病原体感染的体外诊断, 但其应用远不仅于此, 其应用范围相 当广泛,包括:(1鉴定微生物病原体 包括细菌性、病毒性、寄生虫性传染病的临床诊断及食品、 环境等可能污染物的病原体检验。(2确定激素水平 用于评价内分泌功能及妊娠试验,特别是早孕的检验。(3检测肿瘤相关蛋白质 通过检测与肿瘤相关的蛋白质,如癌胚抗原、甲胎蛋白等。 对肿瘤进行早期诊断及治疗后的疗效评价。(4检验血液中的药物含量

50、 包括检测违禁药物,检测治疗药物如庆大霉素、环孢素 等的浓度以确定最佳用药量。(5肿瘤治疗 将肿瘤治疗药物结合到抗肿瘤的特异单克隆抗体上,制成所谓的生物 导弹,利用抗体与肿瘤的特异结合能力,使药物集中到肿瘤部位,减少药物的副作用。 (6其他领域的应用 包括动、植物病原体的检测;分离某些贵重的生物活性物质等。9. 2. 2 DNA诊断技术1978年 Kan 和 Dozy 首先应用羊水细胞 DNA 限制性片段长度多态性 (RFLP作镰状细胞 贫血症的产前诊断,从而开创了 DNA 诊断的新技术, 20多年来, DNA 诊断技术取得了飞 速的发展,建立了多种多样的检测方法,这些检测方法可以用于遗传性疾

51、病、肿瘤、传染性 疾病等多种疾病的诊断。9。 2. 2. 1 PCR技术聚合酶链式反应 (PCB技术是一项体外扩增特异 DNA 片段的技术 (见 2. 1. 3. 1 。这 种方法除了可以用于基因工程目的基因的制备外,还可用于某些疾病的诊断。寻找传染性因子的特异 DNA 序列,以这段 DNA 序列作为靶序列,设计特异引物,对 待测样品进行 PCB .扩增。如果检测出了相应的扩增带,则判定为阳性反应。反之,无扩 增带,则为阴性反应。目前,能够利用 PCI扩增技术进行检验的传染性因子有:结核杆菌、 淋球菌、多种导致腹泻的肠道传染性细菌、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人嗜 T 细胞病毒、乙肝病毒、

52、巨细胞病毒、人乳头状瘤病毒、肠道病毒、肺炎支原体等。表 9-3列出 了一些可行 DNA 诊断的传染性因子。 利用 PCR 技术也可用来进行遗传性疾病的诊断。 有些遗传病是由于基因的缺失引起的。 如。地中海贫血的 Bart 综合征,是由于编码 a 珠蛋白的 a1和 a2基因缺失引起的。选择 特异的引物对这一缺失区域进行扩增, 如果是非缺失的正常个体将会得到一定大小的扩增片 段。反之,具有缺失的遗传病个体没有扩增片段产生或扩增的片段较小。由于大多数遗传性疾病缺乏有效的治疗手段, 所以对于具有某种遗传病的家系的出生前 的胎儿进行产前诊断, 对患病胎儿实施人工流产或引产不失为一条避免遗传病患儿出生,

53、从 而达到优生目的的有效方法。利用 PCR 及下述的 PCR-RFLP , PCR-ASO , LCR , RFLP 等项技术进行产前诊断具有 重要的意义。 这是因为这些技术具有很高的灵敏度, 只要在产前采集极微量的羊水、 绒毛或 脐带血就可进行怀孕早期的诊断而不影响胎儿的正常发育。PCR 检测技术的灵敏度极高,可以检测极微量的病原体,所以可在感染的早期进行诊 断。但也由于其高灵敏度,如果操作不当很容易产生假阳性反应。9. 2. 2. 2 PCR RFLP 技术限制性片段长度多态性 (RFLP是指由于碱基的改变导致 DNA 上的某一限制性内切核酸 酶水解位点增加或减少。当这种 DNA 用内切酶

54、水解时,产生的 DNA 片段数将相应的增加 或减少,并且其 DNA 片段的分子量也发生相应的改变,这种 DNA片段的变化就称为限制 性片段长度多态性 (图 9-2 。许多遗传性疾病就是由于 DNA 上碱基的改变引起的。 如果这种改变正好增加或减少了 DNA 限制性内切核酸酶的水解位点, 那么就可以用 PCR 技术先扩增包括这一突变位置在内 的 DNA 片段,获得大量的 DNA 片段后通过 RFLP 方法进行分9. 2. 2. 3 PCR ASO 技术目前发现的遗传病中, 许多疾病并不是基因的缺失或与限制性内切核酸酶水解位点有关 联的点突变。 绝大部分只是一些单纯的碱基突变, 所以不能用上述的

55、PCR技术或 PCR-RFLP 技术进行诊断。但由于每一种遗传性疾病都有一些经常发生突变的位点,称为突变的热点, 如我国的 地中海贫血的基因突变主要集中在 10个位点上。利用这一特点,可以进行 PCR-ASO 分析。ASO 称为等位基因寡核苷酸。 PCR-ASO 的检测方法是将待测的样品先经 PCR 扩增获 得大量的待分析的 DNA 片段,然后将这些片段分别点样在固相支持膜,如尼龙膜上。另一 方面,人工合成包括突变热点在内的 1730个核苷酸的正常的和突变的寡核苷酸,并分别 进行放射性同位素标记成为寡核苷酸探针。利用这两种探针分别与膜上的 PCR 产物进行杂 交 (见 2. 5. 1. 4 。

56、突变了的基因只能与突变的寡核苷酸探针杂交,而正常的基因只能与正 常的寡核苷酸探针杂交, 通过放射自显影技术便可判断杂交的结果, 从而判断基因的突变与 否。9. 2. 2. 4 PCR-ELISA技术PCR-ELISA 技术是指将 PCR 技术和 ELISA 技术结合起来的一项检验技术。 下面以这一类方法中最简单的双引物双标记法为例介绍这种方法的原理:在 PCR 的一对引 物中, 其中一条引物用生物素标记, 另一条引物用地高辛标记, 酶标微孔板上用生物素的亲 和素包被 (生物素的亲和素可以与生物素特异地结合 。 PCB 扩增后经纯化去除引物、 dNTP 、 引物二聚体等小分子后,将 PCR 扩增

57、后的纯化片段加入到微孔板中。此时,微孔板上包被 的生物素亲和素将与引物上的生物素结合而捕捉了 PCB 片段,再在微孔板中加入碱性磷酸 酯酶或辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体, 该抗体将与另一引物上的地高辛结合从而形成 生物素亲和素生物素 -PCR 片段地高辛抗地高辛抗体酶的复合物。加入酶的相应底 物后进行显色,便可判断 PCR 扩增的有无。根据其原理,该方法主要用于传染性疾病的诊断。如果将该方法再结合分子杂交技术, 如双标记寡核苷酸俘获分析法,则可用于遗传性疾病的分析。由于该方法是 PCB 技术和 EJSA技术的结合, 所以它是一种两级放大系统, 即 PCR 放 大和 EUSA 放大,故而它的

58、灵敏度更高。同时这种方法避免了 PCR 产物分析时的电泳及染 色过程,所以更为快速简便。9. 2. 2. 5 PCR-SSCP技术该方法称为聚合酶链式反应 -DNA 单链构型多态性, 是 1989年 Orita 等建立的。 该方法 的原理是利用正常的和突变的 DNA 单链在三维空间构型上的差异,这种差异在电泳时将会 有不同的电泳格局。其方法是将正常和突变的 DNA 样品经 PCR扩增得到正常和突变的 DNA 片段。将这两种片段变性成为单链,两样品并行地进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。变性后 的 PCR 产物的两条单链 DNA 将按其核苷酸序列的特征形成三维结构,并且突变了的样品 的三维结构与正常的样品的三维结构不同, 从而形成不同的电泳格局。 如果需要, 还可以将 突变的基因进行序列分析, 以确定其突变的确切性质。 该方法在小于 200bp 的 PCR 产物中, 可检出 75%95%的突变。9. 2. 2. 6 PCR-DGGE技术该方法称聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳技术,是将正常基因和突变基因分别进 行 PCR 扩增,然后将扩增后的两种 PCR 产物混合后变性再复性。此时,可形成两种同源双 链 DNA ,即正常的双链 DNA 和突变的双链 DNA ;及两种异源双链 DNA,即正反两种由 正常单链 DNA 和突变单链 DNA 形成的双链