生物化学实验复习总结资料(全)

1、生化实验五大技术.分光光度技术1定义：根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异 的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。2. 根本原理:透光度T=lt /Io吸光度 A=l g(lo/ It)朗伯-比尔(1ambert-Beer)定律:A = KLc【K为吸光率，L为溶液厚度cm，c为溶液浓度mol/L】时,，-在某光吸收定波长下 图摩尔吸光系数1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm 的吸光度。c=A/ £3. 定量分析:1标准曲线(工作曲线)法2比照法3计算法：c=A/ £4差示分析法适用于浓度过浓或过稀5多组分混合物测定分子吸收法&原子吸收

2、法；可见光400760 nm&紫外光200400 nm&红外光大于760 nm分光 光度法；5应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元素一一原子吸收分光光度法二电泳技术1定义：带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分别离成狭窄的区带，用适宜的检测方法 记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。2.根本原理： 球形质点的迁移率与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。 v =Q/6 n r n3. 影响电泳迁移率的因素：电场强度： 电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的pH值：溶液的pH离pl

3、越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大溶液的离子强度 ：电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗： 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4. 技术分类：自由电泳无支持体 区带电泳有支持体：滤纸电泳常压及高压、薄层电泳薄膜及薄板 、凝 胶电泳琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等5. 电泳分析常用方法及其特点：小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 1醋酸纤维素薄膜电泳 这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，消除纸电泳中出现的“拖尾现象 别离速度快，电泳时间短 样品用量少 经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化， 有利于对电泳图谱的 光吸收扫描测定

4、和膜的长期保存一特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测胰岛素、溶菌酶、胎儿甲种球 蛋白(2) 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用 琼脂糖凝胶弹性差，不适合管状电泳-用于等电聚焦、免疫电泳、血清脂蛋白等蛋白质电泳，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 可调节孔径大小 机械强度好，有弹性 分辨率高，用途广 无电渗-用于不同分子量蛋白质的电泳别离(4) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的上下，因此可从 分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分 子量-最常用定性分析蛋白质的电泳方

5、法，特别用于蛋白质纯度检测 &分子量测定(5) 等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质别离等电点不同的蛋白质f由于其分辨率可达O.OIpH单位，因此特别适合于别离分子量相近而等电点不 同的蛋白质组分，适合研究蛋白质的微观不均一性(6) 毛细管电泳 高灵敏度 高分辨率 高效快速 样品少 本钱低一符合对多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等生物大分子的别离条件三. 层析技术固定相：固体物质或者是固定于固体物质上的成分；流动相：可以流动的物质，如水和各种溶媒1原理：当待别离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存 在差异，与两相发生相互作用吸附、溶解、结合等的能力不同，在两相中的 分配含量比

6、照不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再 分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小， 向前移动的速度快。2. 技术分类：按层析原理分类：名称别离原理吸附层析法组份在吸附剂外表吸附，固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相固相中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂结和力不冋凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不冋，因而在凝胶上受阻滞的程度不冋亲和层析法固定相只能与一种待别离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份别离按操作形式不同分类:名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而

7、达别离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份 别离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份别离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的别离3. 层析法的特点与应用 根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量； 析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量， 同时绘出层析图； 层析仪与电子电脑联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间； 分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快-适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的别离分析4. 应用方向柱层析、薄膜层析以硅胶/氧化铝为

8、吸附剂一一别离非极性或极性不强的有 机物离子交换层析一一分子量相对较小的球状蛋白的别离纯化纸层析氨基酸、糖类、肽类、抗生素的别离排阻层析一一别离纯化、分析生物大分子尤其是蛋白质亲和层析法一一适用于蛋白质的别离纯化气象层析 氨基酸、脂肪酸、单糖、双糖、固醇类物质的别离，多肽、蛋白质 结构的测定四离心技术1. 定义：利用旋转运动的离心力，以及物质的 沉降系数或浮力密度的差异进行 别离、浓缩和提纯的一项操作。2. 根本原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力， 加快颗粒的沉降速度， 把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质别离开。颗粒在离心力场下的沉降情况都与沉降速度和沉降时间相关，沉降时间和速度取

9、决于：(1) 离心力；颗粒的大小、形状和密度； 沉降介质的密度和粘度。3. 离心形式：(1) 离心过滤：在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质别离悬浮液的过程为离心过 滤。(2) 离心沉降(或澄清)：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液沉降别离者为离心沉降(如用于净制含少量固体的液体时也称离心澄清 );(3) 离心别离：利用不同溶质颗粒在液体各局部分布的差异，别离不同比重液体 的过程为离心别离。【离心过滤、离心沉降同属固-液别离，离心别离那么属液-液别离】4. 应用方向普通离心机一一物质的别离&提取高速离心机一一对样品中的悬浮物质进行高纯度的别离、 浓缩、精制、提取，多用

10、于血液、细胞、蛋白质、病毒、激素等的别离制备超速离心机既可以别离细胞的亚细胞器，也可以别离生物大分子五.酶学技术1酶活性:即酶促反响速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量注：在实际测定酶促反响速度时，以测定单位时间内产物的生成量为 好2.影响酶活性的因素：酶浓度、底物浓度、温度、PH、抑制剂、激活剂、时 间3. Km值的应用 鉴定酶的种类 反映酶与底物的亲合力Km值越大，酶与底物亲合力越小 选择酶的最适底物 计算不同底物浓度时酶促反响速度相当于最大反响速度的比率 设计适宜的底物浓度4. V max值的应用用来计算酶的转化率TN即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反响的分 子数

11、5. 酶学分析在临床诊断上的应用1在肝脏疾病诊断中的应用2在急性心肌梗死诊断中的应用3在急性胰腺炎诊断中的应用4在骨骼疾病诊断中的应用5在肌肉疾病诊断中的应用7在前列腺疾病诊断中的应用8在肿瘤诊断中的应用生化经典验证性实验?胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素?1. 实验原理：白明胶胶片上蛋白质，黑色 胰酶 肽或氨基酸无色以底片上白明胶的水解程度说明胰酶活性的上下】酶的活性受到酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂、激活剂、时间等影响2. 实验操作：取试管4支，标上序号-按顺序参加所需试剂-混匀、水浴预热 -放入底片全部浸没-水浴间歇摇动试管-立即记录褪色时 间完全或局部 酶浓度对酶活性的影响以

12、酶浓度作为变量：在其他条件不变的情况下，当 S?E时,V与E成正比关系。 温度对酶活性的影响 先置于温度 100°、40°、0°、0°- 13号管放回 40° 保温：在其他条件不变的情况下，一定范围内增加温度，酶反响速度升高；超 过一定的温度范围以后再增加温度， 酶反响速度下降 【最适温度不是酶的特征性 常数】 pH对酶活性的影响pH分别为5.0、7.0、10.0： pH通过影响酶或底物的电 离状态，可影响酶的催化活性。 【最适 pH 不是酶的特征性常数】 抑制剂对酶活性的影响分别参加 NaCI、HgCI2、空白试剂：胰蛋白酶的抑 制剂有重金属

13、离子Hg2+，其与酶结合使酶活性降低或失活。3. 考前须知： 在研究一种因素对酶的活性的时，需要严格的控制反响中其他因素保持不变， 只能改变要研究的某一种因素。 掌握好水解程度是本实验的关键之一。 HgCI2有毒，操作时要格外小心，严防中毒。二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳1. 实验原理： 以醋酸纤维素醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样 品无拖尾和吸附现象等优点为电泳支持物，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，血清 蛋白全部带负电荷，在直流电场中向正极移动，移动速度与蛋白质所带电荷成正 比，与颗粒大小成反比。120V电泳45min后，用氨基黑10B染色，可将血清依 次分为清蛋白最远、

14、a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B -球蛋白、丫 -球蛋白 洗脱法定量：血清蛋白组分的相对百分数=Ax十A总X 100%清蛋白：球蛋白=A清*( A a 1+A a 2+A b +A 丫)2. 实验操作:准备一标记粗糙面、铅笔划线一点样粗糙面一电泳点样面向下，点样 端置于负极一染色多条薄膜时应逐条浸入一漂洗注意控制染色和漂洗的 时间，防止背景过深或某些区带太浅 一洗脱定量法定量剪下各蛋白区带 将洗脱液用分光光度计比色3. 考前须知： 点样时，应将薄膜外表多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极

15、端，且点样面向下。 应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或 造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。三.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用1. 实验原理： 琥珀酸脱氢酶是一种重要的脱氢酶，其辅基为 FAD，在缺氧的情况下，可使 琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝复原成无色的甲烯白。珈顒+甲烯蓝聃瞰脱誦延曲黠斗彌白无氧条件 丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。假 设琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，那么不能再催化琥珀酸脱氢，即无法使甲烯蓝变 为无色甲烯白。 竞争抑制剂使酶的Km T, Vmax不变，抑制程度取决于酶与抑制剂的相

16、对亲2. 实验操作:酶提取液的制备一取试管6支，编号-按图步骤操作酶提取液ml磷酸缓冲液ml0.2mol/L琥珀酸滴0.02mol/L琥珀酸滴0.2mol/L丙二酸溶液滴0.02mol /L丙二 酸溶液滴蒸馏水滴甲烯蓝滴试管12-8-83试管22-8-8-3试管32-8-8-3试管42-88-3试管5-28-83试管62-8-83试管6,在酶提取液先在100C的水浴加热煮沸5min一各管溶液立即混均匀，沿试管壁参加液体石蜡一各管置于37C的水浴中保温,切勿摇动试管，随时观察比拟各试管颜色的变化，记录褪色时间3. 考前须知： 酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 参加液体石蜡的作用是隔绝

17、空气，以防止空气中的氧气对实验造成影响， 因此 加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要产生气泡。 37C水浴保温过程中，不能摇动试管，防止空气中的氧气接触反响溶液， 使得 复原型的甲烯白重新氧化成蓝色。 实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。四. 猪肝中核酸的提取与鉴定1. 实验原理：核蛋白的提取:三氯醋酸肝组织匀浆一L核蛋白沉淀原因：三氯醋酸可沉淀蛋白质从核蛋白中提取核酸：10%NaCI核蛋白 1核樹 +蛋白质沉淀原因：忆的NmCI潯港抽fit跚»t墨白農的诲髯度低10%N»CI核蛋白 -核酸钠4蛋白质沉淀9S%Zlff垓瞬沉淙核酸DNA、RNA丨成分的鉴定相酸镀氮基蔡酚

18、磺酸 1 1磷相酸钳蓝蓝色浓硫酸3,卜二轻基甲垛糠薛1f绿色化合物浓酸1苯讓1氧核精 一，«-轻基-酮基戊薛-1蓝色化合钏2. 实验操作： 匀浆制备 别离抽提：将肝匀浆倒入离心管内f参加 2%三氯醋酸4ml，搅拌后静置3分钟f 3000转离心5分钟f倾去上清液，向沉淀中参加95%乙醇，搅匀后置于沸水中加热 2minf冷却后离心5minf倾去上层酒精液，在沉淀中参加10% NaCl溶液4ml搅匀f置于 沸水 中加热8分钟并不断搅拌f冷却后 离心3000转每分钟，5分钟f将上清液倒入小烧 杯内f取等量的95%乙醇，逐步滴加小烧杯内，边加边摇匀 f白色沉淀逐渐出现后， 静置10分钟f将小烧

19、杯内容物倒入离心管，离心3000转每分钟，5分钟f倾倒上清液即得到核酸钠的白色沉淀 RNA与DNA的成分的鉴定3. 考前须知： 在离心管平衡后，对称放入离心机，切忌将没加管套的离心管放入离心机， 离 心完后取出离心管 防止液体洒在离心机上面或钻头上 启动离心机后，离心机如有不正常反响或噪音，应立即停止离心，并分析原因五. 双缩脲法测定血清蛋白质含量1. 实验原理： 血清中蛋白质的多肽的肽键-CO-NH-在碱性溶液中能与2价铜离子作用生 成稳定的紫红色络合物。蛋白质+CuSO+O4紫红色络合物这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含 量呈正比关系，经与同样处理的

20、蛋白质标准液比拟，即可求得蛋白质含量。 利用吸收光谱对蛋白质进行定量分析最大波长位于 540nm处1标准曲线法2标准管法G/Ax=C/As, 测定As、Ac,可求得CX2.实验操作：取7支试管，编号，按照图1操作并记录。空白管标准管测定管12345蛋白质标准液-1.0-待测血清样本-1.0氯化钠溶液1.0-双锁脲试剂4.04.04.0P 4.04.04.04.0入光吸收值0混匀各管，室温放置10min，以空白管调零，在波长540nm比色，读取 各管光吸收值。3.考前须知：须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 用分光光度计要注意：取

21、吸收池时， 应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面， 以免粘上油污；液体的体积为比色杯的2/3-3/4;不要将比色杯放在分光光度计上； 试验完成后，关闭电源，洗净比色皿。六. 纸层析法观察转氨基作用1. 实验原理： 氨基酸的转氨基作用溶质层祈点中程到原点中心的距离 m国=溶剂前缘到原点中心的距离实验组发生转氨基反响，最后体系中有两种氨基酸；对照组不发生转氨基反响，体系中只有一种氨基酸； 纸层析法分配层析：滤纸一一支持物固定相一一水 流动相一一乙醇有机溶剂由于混合物中的各成分的分配系数不同，别离受固定相的阻力和受流动相的推力 影响不同，各组分移动速度不同，有效成分和杂质在这两个相中连续屡次地进行 分

22、配、吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到别离。 在固定相中分配趋势较大的组分，随流动相移动的速率较慢，不同组分在纸上 移动的速率不同，用Rf表示：Rf=溶质中心到原点中心的距离/溶剂前缘到原点中心的距离物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故比移值Rf可用来鉴别被别离的物质。2. 实验操作： 肝匀浆的制备 转氨基反响：取干净试管2支，分别标明测定管与对照管，按下表操作试剂 d测定管对照管肝匀浆101037 C 水浴 10mi n沸水浴 10min丙氨酸1010a酮戊二酸1010点样 注意点样斑点不可太大，直径应小于0.5cm 层析：在滤纸圆心处打一小孔，另取同类滤纸卷成圆筒如灯芯插入小孔； 将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液中 , 待溶剂前沿距滤纸边缘约 1/3 处， 取出滤纸。 显色 /染色：将上述滤纸平放在培养皿