基因工程常用分子生物学技术

1、一、电泳的原理一、电泳的原理 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。子大小、极性、介质的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，所以，DNA和和RNA实际

2、上呈多聚阴离子状态实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将）。将DNA、RNA放到电场中，它就会放到电场中，它就会由负极由负极正极移动。正极移动。常用固体支持介质常用固体支持介质琼脂糖（琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（和聚丙烯酰胺（polyarylamide）都属于固体支持介都属于固体支持介质，使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，使得被分质，使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，使得被分离的成分得到最大的分辨率。这些固体支持介质可以形成复杂的网孔离的成分得到最大的分辨率。这些固体支持介质可以形成复杂的网孔结构，结构，DNA要穿过这些网孔才能到达正极，因此分

3、子量小，结构致密要穿过这些网孔才能到达正极，因此分子量小，结构致密的的DNA分子就更容易穿过这些网孔，泳动的速度也越快。分子就更容易穿过这些网孔，泳动的速度也越快。 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA片段的大小范围片段的大小范围 0.3%琼脂糖琼脂糖 5000010000.7%琼脂糖琼脂糖 2000010001.4%琼脂糖琼脂糖 60003004%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1000 10010%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 500 2520%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50 1琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力片段的能力琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分

4、琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分子结构大部分是由子结构大部分是由1,3联接的联接的-吡喃半乳糖，吡喃半乳糖，1，4联接的联接的3，6脱水脱水-D吡喃半乳糖交替而成的，其结构为：吡喃半乳糖交替而成的，其结构为： 在凝胶电泳中，一在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此染色，此时，核酸分子在紫时，核酸分子在紫外光下发出荧光，外光下发出荧光，肉眼能看到约肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。所形成的条带。染色：染色：聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N-甲叉双丙烯酰胺聚合甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这两种成分

5、在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯酰胺的单体形成长链，由酰胺的单体形成长链，由N，N-甲叉双丙烯酰胺的双功能甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。 丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢，为中枢神经毒物。神经毒物。N，N-甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无味，分子量为味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液与的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的

6、确切致死量（皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50）为为170mg/，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触和吸入粉尘。触和吸入粉尘。 聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基，而增速剂条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N，N-四甲基四甲基乙二铵（乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，从而加速聚合。从而加速聚合。 探针（探针（probe）：）：用来探知被测物存在的小分子用来探知被测物存在的小分子DNA或或RN

7、A。标记物：探针上结合的易被检测的化合物。标记物：探针上结合的易被检测的化合物。分子杂交（分子杂交（molecular hybridization）：）：探针探针DNA或或RNA与与被测物的互补结合叫分子杂交。被测物的互补结合叫分子杂交。探针探针核酸探针：核酸探针：DNA、RNA非核酸探针：酶、蛋白质等非核酸探针：酶、蛋白质等 双链双链DNA探针探针 DNA探针探针 DNA探针探针核酸探针核酸探针 单链单链DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 单链单链RNA探针探针 放射性标记探针放射性标记探针 均匀标记探针均匀标记探针探针标记探针标记 非放射性标记探针非放射性标记探针 非均匀的末

8、端标记探针非均匀的末端标记探针 核酸探针的类型和称谓常有以下几种：核酸探针的类型和称谓常有以下几种： 切口平移法切口平移法 利用了利用了DNaseI和和DNA聚合酶聚合酶I的的5 3 聚合酶活性和聚合酶活性和5 3外切酶活性。产生均匀标记的探针。外切酶活性。产生均匀标记的探针。 随机引物合成法随机引物合成法原理：随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与原理：随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结模板结合合，在在Klenow酶的作用下酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的DNA探针。探针。 优点是：优点是：(1)Klenow片段没有片段没有53外切酶活性外切酶活性,反反应稳定应稳

9、定,可以获得大量的有效探针。可以获得大量的有效探针。(2)(2)反应时对模板的要求不严格反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高反应产物的比活性较高,可达可达4109 cpm/g探针。探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。 从从M13载体衍生序列合成单链载体衍生序列合成单链DNA探针探针 双链探针的缺点：易形成自身无效杂交。双链探针的缺点：易形成自身无效杂交。-32P-dNTP限制性酶切割电泳分离方法：方法： 用寡聚用寡聚dT为引物合成为引物合成c

10、DNA探针。探针。本方法只能用于本方法只能用于带带Poly(A)的的mRNA，并且产生的探针极大多数偏向于并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3末端序列。末端序列。 可用随机引物合成可用随机引物合成cDNA探针。探针。该法可避免上述缺该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常中通常含有多种不同的含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列，往往比分子，所得探针的序列，往往比以克隆以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量富集富集mRNA中的目的序列。中的目的序列。 反转录得到的产物反转录得到的产物

11、RNA/DNA杂交双链经碱变性后，杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经单链可被迅速地降解成小片段，经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。柱层析即可得到单链探针。 若只知道待分离的目的基因的蛋白质编码产物，而对其核若只知道待分离的目的基因的蛋白质编码产物，而对其核苷酸序列一无所知，即可设计合成寡核苷酸探针。苷酸序列一无所知，即可设计合成寡核苷酸探针。种类种类单一已知序列的寡核苷酸探针单一已知序列的寡核苷酸探针许多兼并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库许多兼并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库存在困难：存在困难：（1）所合成的寡核苷酸探针必须严格地只能同目的基因）

12、所合成的寡核苷酸探针必须严格地只能同目的基因的的cDNA序列互补。所以一般得掌握一段由序列互补。所以一般得掌握一段由6个连续排列个连续排列的氨基酸组成的蛋白质序列的数据。的氨基酸组成的蛋白质序列的数据。（2）遗传密码的兼并性问题。）遗传密码的兼并性问题。因此，根据蛋白质序列所合成的寡核苷酸探针，通常是因此，根据蛋白质序列所合成的寡核苷酸探针，通常是混合物形式。混合物形式。RNA探针的优点：探针的优点：许多载体如许多载体如pBluescript,，pGEM等均带有来自噬菌体等均带有来自噬菌体SP6或或E.coli噬菌体噬菌体T7或或T3的启动子，它们能特异性地被各自噬菌体的启动子，它们能特异性地

13、被各自噬菌体编码的依赖于编码的依赖于DNA的的RNA聚合酶所识别，合成特异性的聚合酶所识别，合成特异性的RNA。 （1）稳定性高，杂交信号强。）稳定性高，杂交信号强。（2）RNA/RNA杂交体用杂交体用RNaseA酶切较用酶切较用S1酶切酶切DNA/RNA杂杂交体容易控制。交体容易控制。（3）产量高。）产量高。（4）用无）用无RNA酶的酶的DNA酶处理即可去除模板。酶处理即可去除模板。（5）启动子特异性高，故在异常位点起始）启动子特异性高，故在异常位点起始RNA合成比率很低。合成比率很低。二、非核苷酸探针二、非核苷酸探针被检测对象：蛋白质，可视为抗原。被检测对象：蛋白质，可视为抗原。抗原抗原完

14、全抗原：具有免疫原性和反应原性。完全抗原：具有免疫原性和反应原性。 半抗原：无免疫原性，有反应原性。半抗原：无免疫原性，有反应原性。方法：方法：ELISA图探针：可视为抗体。探针：可视为抗体。三、探针的标记三、探针的标记筛选探针的考虑因素：筛选探针的考虑因素：（1）标记前后探针的结构、理化性质、）标记前后探针的结构、理化性质、Tm值等不变。值等不变。（2）检测灵敏度高。）检测灵敏度高。（3）安全、无污染。）安全、无污染。（4）经济）经济1、放射性标记、放射性标记主要用等放射性同位素标记核苷酸。主要用等放射性同位素标记核苷酸。2、非放射性标记、非放射性标记主要有生物素、酶类、荧光素，它们可使一些

15、化合物生成有色主要有生物素、酶类、荧光素，它们可使一些化合物生成有色物质，通过检测颜色反应来判断抗原的有无。物质，通过检测颜色反应来判断抗原的有无。例：地高辛标记探针检出原理例：地高辛标记探针检出原理步骤：（1）将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为）将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹。核酸印迹。（2）将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记）将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的的DNA或或RNA探针杂交。故有时也称印迹杂交。探针杂交。故有时也称印迹杂交。（1）DNA片段的转移。将电泳后的琼脂糖凝胶片段的转移。将电泳后的琼脂糖凝胶先作碱变性先作碱变

16、性处理处理，经中和处理后凉干备用。然后将处理好的凝胶放到，经中和处理后凉干备用。然后将处理好的凝胶放到Southern转膜装置中，其装置如下（见图）：在一个装有缓转膜装置中，其装置如下（见图）：在一个装有缓冲液的磁盘中放一个玻璃架，铺冲液的磁盘中放一个玻璃架，铺Whatman滤纸一张，务使滤纸一张，务使滤纸两端浸入缓冲液冲。变性的凝胶平铺在滤纸上，在凝胶滤纸两端浸入缓冲液冲。变性的凝胶平铺在滤纸上，在凝胶上面盖上一张硝酸纤维素滤膜，再加一叠干滤纸，最后再压上面盖上一张硝酸纤维素滤膜，再加一叠干滤纸，最后再压上一重物。由于上面干滤纸的吸引作用，下面的缓冲液就会上一重物。由于上面干滤纸的吸引作用，

17、下面的缓冲液就会通过滤纸的毛细管上升，造成由下到上的液体流，凝胶中的通过滤纸的毛细管上升，造成由下到上的液体流，凝胶中的单链单链DNA便会随着缓冲液一起转移。一旦便会随着缓冲液一起转移。一旦DNA分子接触到分子接触到硝酶纤维素滤膜，就会牢牢地吸附而固定在上面。转移结束硝酶纤维素滤膜，就会牢牢地吸附而固定在上面。转移结束后将硝酶纤维素滤膜夹在两层滤纸中间后将硝酶纤维素滤膜夹在两层滤纸中间80下烘干下烘干12小时。小时。 （2）分子杂交）分子杂交（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X

18、光底片光底片ELISAELISA的方法程序是：将某将某一基因产物（抗原，从供体一基因产物（抗原，从供体中提取、纯化），制成抗原中提取、纯化），制成抗原制剂制剂抗原制剂注射到免疫抗原制剂注射到免疫动物（鸡、鸭、兔、羊等，动物（鸡、鸭、兔、羊等，兔子最好）体内兔子最好）体内36周复周复注射，加强免疫注射，加强免疫7-10天后天后提取动物血液，分离出血清，提取动物血液，分离出血清，叫抗血清（经免疫后，有抗叫抗血清（经免疫后，有抗体，主要是体，主要是球蛋白，的球蛋白，的动物血清）动物血清）纯化纯化球蛋球蛋白，即一抗白，即一抗与有关酶偶联与有关酶偶联制备酶标一抗。若需要时，制备酶标一抗。若需要时，要制备

19、酶标二抗，方法同一要制备酶标二抗，方法同一抗。抗。 第四节第四节 PCRPCR技术技术一、一、PCR技术的原理技术的原理（1 1）高温变性，）高温变性，双链双链DNA变性（变性（9095）成为单链）成为单链DNA；PCR步骤：步骤：（2 2）低温退火（）低温退火（37-60） ，引物与单链，引物与单链DNA互补序列结合；互补序列结合；（3）适温延伸，适温延伸，DNA聚合酶催化（聚合酶催化（70-75）使引物延伸。）使引物延伸。 其原理是：以其原理是：以DNA的一条链为模板，在有的一条链为模板，在有RNA引物、引物、4种脱氧种脱氧核苷酸（核苷酸（dNTP）时，和时，和DNA聚合酶的条件下，在引物

20、所结合聚合酶的条件下，在引物所结合的位置向的位置向3方向合成新的互补链。其反应以双链方向合成新的互补链。其反应以双链DNADNA的变性、的变性、退火、延伸为一个循环。经过多次循环（退火、延伸为一个循环。经过多次循环（25-30次），便目标次），便目标DNA片段得以大量扩增。由于每一次循环所产生的新链均可成片段得以大量扩增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的模板用于下一轮循环，故为新的模板用于下一轮循环，故PCR产物以指数方式增加。产物以指数方式增加。 ParameterConcentrationTemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+ oncentrationEn

21、zymeTotal volume10 attomoles(1106 molecules)8.4（10mM Tris-Hcl）200 M(each one)100 g/ml (optional)0.5 M(each one);(0.11.0M)0.5mM50% at 95 for 40 min1.110-4 substitutions per cycle0.5mM10mM5 to 3only5 adenosines1、Taq DNA聚合酶聚合酶 1976年，年，Chien.A从一种生活在温度高达从一种生活在温度高达75的热泉的细的热泉的细菌（即栖热水生菌菌（即栖热水生菌，Thermus Aqua

22、ticus）中分离纯化出了一中分离纯化出了一种耐高温的种耐高温的DNA聚合酶，现命名为聚合酶，现命名为TaqDNA聚合酶。这种酶聚合酶。这种酶经经95持续温育仍有活性，因此在持续温育仍有活性，因此在DNA变性加热的温度下不变性加热的温度下不会失活，故无需在每轮反应中补加新酶。会失活，故无需在每轮反应中补加新酶。 TaqDNA聚合酶与聚合酶与Klenow大片段相比，缺少大片段相比，缺少35的的外切核酸功能，但具有外切核酸功能，但具有53的外切核酸酶功能，故的外切核酸酶功能，故Taq酶缺少校对活性。酶缺少校对活性。 Rappolee指出引物设计需要根据以下原则：（1）引物应是DNA序列的一段高保守

23、区；（2）引物3端的保守序列很重要，并要求非简并性密码，密码的第三个碱基不应摇摆；（3）引物3端不能互补，不能具有反转重复序列，避免形成引物二聚体；（4）引物的设计应避免形成二级结构；（5）避免引物中G/C和A/T富聚区的不平衡分布，但允许有OligodT和polydC；（6）引物是特异性的，不能与其它基因的序列同源；（7）根据实验设计要求可以在引物5端进行特殊设计，即加入几个碱基以便在扩增产物中创造一个限制性酶切位点，或一个GC box，或一个启动子。较长的引物-模板杂合体的Tm值较高，因此在PCR的最初几次循环之后需要适当增加融合温度；（8）为了进行未知序列的扩增，需要对引物进行特殊设计。

24、 4、用于、用于PCR扩增的扩增的dNTP 单链、双链单链、双链DNA以及通过逆转录的以及通过逆转录的cDNA都可以作为都可以作为PCR反应的模板。无论哪种反应的模板。无论哪种DNA，都要具有较高的纯度。模都要具有较高的纯度。模板板DNA的用量，依的用量，依DNA的性质而定。的性质而定。 PCR扩增使用的扩增使用的dNTP的浓度一般为的浓度一般为50200mol/L。对对于典型的于典型的PCR扩增反应，一般要求四种扩增反应，一般要求四种dNTP的浓度相等。的浓度相等。 用于用于PCR的标准缓冲液中含有：的标准缓冲液中含有：50mmol/LKCL、10mmol/L TrisCl（pH8.3，于室

25、温于室温)和和1.5mmol/L MgCl2。其中其中Mg2+对对PCR反应的成败起着关键作用。镁离子的最佳反应的成败起着关键作用。镁离子的最佳作用浓度相当低（作用浓度相当低（1.5mmol/L）。）。 5、用于、用于PCR的缓冲液的缓冲液PCR反应管中往往要加入适当的灭菌矿物油，以防止反应液反应管中往往要加入适当的灭菌矿物油，以防止反应液在高温下的蒸发并减少污染。但矿物油的用量一定要适当，太在高温下的蒸发并减少污染。但矿物油的用量一定要适当，太少起不到应有的作用，太多又会降低热循环效率，一般是在少起不到应有的作用，太多又会降低热循环效率，一般是在100ul反应体积中加反应体积中加70ul，5

26、0ul体积加体积加40ul，25ul反应体积加反应体积加30ul。6、矿物油、矿物油7、循环次数循环次数 分析性分析性PCR的最适循环次数是的最适循环次数是2535次，即使微量的次，即使微量的PCR产物也能用琼脂糖凝胶电泳检测，而制备性产物也能用琼脂糖凝胶电泳检测，而制备性PCR是循环是循环次数不能超过次数不能超过40次。循环次数太多是不利的，会使非特异性次。循环次数太多是不利的，会使非特异性扩增产物增加。扩增产物增加。一、一、Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 这种方法利用这种方法利用DNA聚合酶的两个性质：聚合酶的两个性质：（1 1）在有单链模板、引物，带有）在有单链模板、引物，带有

27、3-OH末端的引物，末端的引物，4种种dNTP存在时，存在时，DNA聚合酶能够以单链聚合酶能够以单链DNA作为模板，按照碱作为模板，按照碱基互补配对原则，不断将基互补配对原则，不断将dNTP加到引物加到引物3-OH末端，合成出末端，合成出与单链模板互补的新链。与单链模板互补的新链。（2 2）DNA聚合酶还可以聚合酶还可以ddNTP（2,3-双脱氧核苷酸）作双脱氧核苷酸）作为底物，使之掺入到正在延伸的为底物，使之掺入到正在延伸的DNA链中，但是由于链中，但是由于ddNTP缺缺少少3-OH，无法和下一个核苷酸之间形成无法和下一个核苷酸之间形成3，5-磷酸二酯磷酸二酯键，所以在键，所以在ddNTP掺

28、入的位置，链延长终止。掺入的位置，链延长终止。 脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP）和双脱氧核苷三磷酸（和双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）的分子结构式的分子结构式 Sanger双脱氧链终止双脱氧链终止DNA序列分析法原理序列分析法原理 C T G A C T T C G A C A AT G T TddATP，dNTPC T G A C T T C G A C A AG C T G T TC T G A C T T C G A C A AA G C T G T TC T G A C T T C G A C A AC T G A A G C T G T TAAAA（1）（2）（3）表表17-

29、1 Maxam-Gilbert法所用的化学修饰技术法所用的化学修饰技术碱基碱基特异修饰方法特异修饰方法G在在pH8.0下，用硫酸二甲酯对下，用硫酸二甲酯对N7进行甲基化，使进行甲基化，使C8C9键对碱键对碱裂解具有特异的敏感性裂解具有特异的敏感性A+G在在pH2.0下，哌啶甲酸可以使嘌呤环的下，哌啶甲酸可以使嘌呤环的N原子质子化，从而导致原子质子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去C在在1.5mol/LNaCl存在下，只有胞嘧啶可同肼发生明显

30、可见的反存在下，只有胞嘧啶可同肼发生明显可见的反应应A+C在在90下，用下，用1.2mol/LNaOH处理，可使处理，可使A位点发生剧烈的断裂位点发生剧烈的断裂反应，而反应，而C位点的断裂反应较微弱位点的断裂反应较微弱 化学法是对一个末端标记的化学法是对一个末端标记的DNA片段，用化片段，用化学试剂在学试剂在A、G、C C、T处特定地裂解处特定地裂解DNA片段。把片段。把反应分为四组，每一组反应特异性地针对某一种反应分为四组，每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基，并且要保证每个或某一类碱基，并且要保证每个DNA分子平均只分子平均只有一个靶碱基被修饰，这样，在每一组反应中虽有一个靶碱基被修饰

31、，这样，在每一组反应中虽然都在同一个或两个核苷酸处然都在同一个或两个核苷酸处DNA链发生断裂，链发生断裂，但由于碱基位置不同，就会产生一组不同长度的但由于碱基位置不同，就会产生一组不同长度的DNA片段。最后，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳片段。最后，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后就可读出待测分离，放射自显影后就可读出待测DNA的核苷酸的核苷酸序列。序列。（1）首先用一个限制性酶消化待测）首先用一个限制性酶消化待测DNA片段，片段，得到长度为得到长度为100200bp的一组片段。的一组片段。（2）用碱性磷酸酶处理，这些）用碱性磷酸酶处理，这些DNA片段，使其片段，使其脱去脱去5磷酸。磷

32、酸。（3）通过多核苷酸激酶的催化作用，将）通过多核苷酸激酶的催化作用，将r32PNTP的放射性磷酸转移到的放射性磷酸转移到DNA片段的片段的5端，给端，给DNA片片段段5末端作上放射性标记。末端作上放射性标记。（4）将标记的双链）将标记的双链DNA变性成单链。变性成单链。（5）对特定碱基进行化学修饰。）对特定碱基进行化学修饰。 A C T T C G A C A AA C T T C G A C A AC A AC G A C A AC T T C G A C A AC A AC G A C A AC T T C G A C A AT C G A C A AT T C G A C A A369

33、36978CC+TCC+T369四、DNA序列分析的自动化随机引物测出的序列作为下一次引物二轮测出的序列设计为二轮引物 寡核苷酸片段的固相合成有两种基本方法，一种寡核苷酸片段的固相合成有两种基本方法，一种叫做磷酸三酯法，另一种叫做亚磷酸三酯法。这两种叫做磷酸三酯法，另一种叫做亚磷酸三酯法。这两种方法的步骤基本相同，都是将活化了的核苷酸在存在方法的步骤基本相同，都是将活化了的核苷酸在存在特定偶联试剂的条件下依次同与固相载体相连的核苷特定偶联试剂的条件下依次同与固相载体相连的核苷5羟基产生偶联反应，从而在参加的两核苷酸之间形羟基产生偶联反应，从而在参加的两核苷酸之间形成磷酸三酯键。磷酸三酯法主要包

34、括：偶联反应，封成磷酸三酯键。磷酸三酯法主要包括：偶联反应，封闭反应，去闭反应，去5端保护基反应。而亚磷酸三酯法除了上端保护基反应。而亚磷酸三酯法除了上述几个步骤外，还有一个氧化反应，即使亚磷酸三酯述几个步骤外，还有一个氧化反应，即使亚磷酸三酯键转变为磷酸三酯键。现在，磷酸三酯法已不再使用，键转变为磷酸三酯键。现在，磷酸三酯法已不再使用，在在DNA自动合成仪上使用的均是亚磷酸三酯法。自动合成仪上使用的均是亚磷酸三酯法。寡核苷酸化学合成中所用的单体为亚磷酰胺，可分为两种类寡核苷酸化学合成中所用的单体为亚磷酰胺，可分为两种类型：甲基化的亚磷酰胺和型：甲基化的亚磷酰胺和-氰乙基氰乙基-亚磷酰胺。亚磷

35、酰胺。 1脱三苯甲氧基作用。脱三苯甲氧基作用。 2偶联反应。偶联反应。 3闭封反应。闭封反应。 4氧化反应。氧化反应。 DNA片段的合成就是上述四个反应循环进行，直片段的合成就是上述四个反应循环进行，直至合成出所需长度的寡核苷酸片段为止。至合成出所需长度的寡核苷酸片段为止。DNA片段的片段的化学合成是化学合成是35方向进行。当合成反应终止后，方向进行。当合成反应终止后，需将脱氧核苷酸上的保护基团去除，并将合成的寡核需将脱氧核苷酸上的保护基团去除，并将合成的寡核苷酸链从固相载体上释放出来，然后，用乙醇沉淀法苷酸链从固相载体上释放出来，然后，用乙醇沉淀法纯化这些寡核苷酸，再用高效液相色谱法或凝胶电

36、泳纯化这些寡核苷酸，再用高效液相色谱法或凝胶电泳法使之进一步纯化，并同未完成全段合成的较短片段法使之进一步纯化，并同未完成全段合成的较短片段分开，最后得到真正需要的产物。分开，最后得到真正需要的产物。 遗传标记主要有遗传标记主要有4种类型，即形态标记、细胞种类型，即形态标记、细胞学标记，生化标记和分子标记学标记，生化标记和分子标记。形态标记是以生物的外部特征，如：株高、穗长、粒形态标记是以生物的外部特征，如：株高、穗长、粒色、花色、粒重等宏观性状作为遗传研究的标志。色、花色、粒重等宏观性状作为遗传研究的标志。最初的细胞学标记主要是指染色体的核型，后来又发最初的细胞学标记主要是指染色体的核型，后

37、来又发展出了染色体显带技术。展出了染色体显带技术。生化标记主要指同工酶。生化标记主要指同工酶。广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异DNA序列、序列、RNA或蛋白质。狭义的分子标记仅指或蛋白质。狭义的分子标记仅指DNA或或RNA标记。标记。一、一、RFLP标记标记1、原理、原理RFLP指应用特定的核酸内切酶切割有关的指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子所分子所产生的产生的DNA片段在长度上的变化。片段在长度上的变化。细胞内细胞内DNA量通常用绝对量（量通常用绝对量（Pg）或碱基对（）或碱基对（bp）数目）数目表示，也常用千碱基对（表示，也常用千碱基对

38、（Kb）或万碱基对（）或万碱基对（Mb）表示。）表示。1Pg=0.965109bp=6.11011dalton=29cM生物能快速、精确地复制自身的生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精确性，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。的碱基序列是相同的。限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解DNA长链，是识别长链，是识别DNA上的特异的位点上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位

39、点碱基对越少，并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对越少，DNA分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，至同一品种的不同的两个个体之间，DNA会发生变异，其中会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。段长度的多态

40、性。用限制性酶来酶解植物核用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。进行能分辨。进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核DNA的的RFLP。0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb0.3kb0.4kb0.5k

41、b(1)(2)0.2kb0.3kb0.5kb品系品系1 品系品系20.4kb0.1kb+3、RFLP的方法与步骤的方法与步骤（1）DNA的分离的分离（2）酶切）酶切（3）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳（4） Southern印迹转移印迹转移（5）DNA杂交及放射自显影杂交及放射自显影可用可用CTAB法或法或SDS法。法。一般根据基因组总一般根据基因组总DNA的复杂性选用限制酶。的复杂性选用限制酶。二、二、RAPD技术技术1990年，由美国杜邦公司的科学家年，由美国杜邦公司的科学家Williams推出。推出。与与RFLP相比的优越之处：检测效率高、样品用量少、灵相比的优越之处：检测效率高、样品用

42、量少、灵敏度高等。敏度高等。缺点：缺点：（1）由于采用的引物的）由于采用的引物的Tm值较低，扩增结果易值较低，扩增结果易受外界因素的影响，实验的重复性差。受外界因素的影响，实验的重复性差。（2）RAPD为显性标记，不能提供完整的遗传信息。为显性标记，不能提供完整的遗传信息。（一）（一）RAPD的基本概念和原理的基本概念和原理RAPD的引物的引物: （1）为随机引物，）为随机引物，（2）序列较短（通常为）序列较短（通常为10个核苷酸）个核苷酸）（3）为一个寡核苷酸单链引物）为一个寡核苷酸单链引物 RAPD方法是在方法是在PCR技术基础上发展起来的，它利用技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机

43、引物（通常为一系列单个随机引物（通常为10个核苷酸），对所研究的个核苷酸），对所研究的基因组基因组DNA进行进行PCR扩增，引物与基因组扩增，引物与基因组DNA某一区段某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游互补时，就与其结合，就可对引物下游DNA进行合成，即进行合成，即扩增。扩增。 0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.3kb0.5kb品系品系1 品系品系2(三三)RAPD的基本实验程序的基本实验程序1、DNA的提取的提取（1）碱法）碱法 （2）CTAB法法 （3）SDS法法2、模板、模板DNA浓度和质量的检测浓度和质量的检测3、PCR扩增扩增4、电泳检

44、测：、电泳检测：PCR结束后每个样品加结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲液，凝胶上样缓冲液，每个泳道点样每个泳道点样20ul。5、将凝胶浸于、将凝胶浸于1ug/ml的的EB中中30min60min，用水，用水清洗约清洗约10min。6、观察、拍照。、观察、拍照。三、AFLPAFLP技术是技术是1992年由荷兰年由荷兰Keygene公司的科公司的科学家学家Zabeau Mare和和Vos Pieter发明并发展起发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。（一）（一）AFLP的基本原理的基本原理 其其原理原理是选择性地扩增基因组是选择性地扩增基因组DNA限

45、制性酶切限制性酶切片段。植物基因组片段。植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将对分子量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定的接头连接在这些特定的接头连接在这些DNA片段两端，接头序列和片段两端，接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行邻近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增，最后扩增，最后通过通过PAGE分离扩增的特异限制性片段。在不需要分离扩增的特异限制性片段。在不需要DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段。个反应中检测到大量的片段。AFLP引物是

46、一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为1820个核苷酸。引物主要由个核苷酸。引物主要由3部分组成：部分组成：（1）核心序列（）核心序列（CORE），该序列与人工接头互补；），该序列与人工接头互补；（2）限制性内切酶识别特异序列（）限制性内切酶识别特异序列（ENZ）；）；（3）选择性延伸序列（）选择性延伸序列（EXT），即引物），即引物3端的选择碱基，端的选择碱基，选择碱基延伸到选择碱基延伸到酶切片段区酶切片段区。如：如：EcoRI引物和引物和MseI引物引物COREENZEXTEcoRI 5 -GACTGCGTACC AATTC NNN-3 MseI 5 -GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3四、SSR技术 真核生物基因组中散布着大量的小卫星真核生物基因组中散布着大量的小卫星DNA和微和微卫星卫星DNA，小卫星，小卫星DNA由串联重复的短序列组成，由串联重复的短序列组成，它的重复单位一般在十几到几十它的重