氨基酸和蛋白质一级结构ppt课件

1、1氨基酸和蛋白质的一级构造氨基酸和蛋白质的一级构造1.1 蛋白质是由二十种不同的氨基酸构成的蛋白质是由二十种不同的氨基酸构成的 1.1.1 二十种氨基酸可以按其侧链分类二十种氨基酸可以按其侧链分类 1.1.2氨基酸的离子形状取决于环境的氨基酸的离子形状取决于环境的pH 1.1.3 运用离子交换层析可将各种氨基酸分开运用离子交换层析可将各种氨基酸分开 1.1.4 氨基酸可进展特征的化学反响氨基酸可进展特征的化学反响1.2蛋白质中的氨基酸是经过肽键衔接的蛋白质中的氨基酸是经过肽键衔接的 1.3肽可以化学合成肽可以化学合成1.4蛋白质可以经过各种生物化学技术纯化蛋白质可以经过各种生物化学技术纯化 1

2、.4.1柱层析常用于蛋白质的分别纯化柱层析常用于蛋白质的分别纯化 1.4.2电泳分别蛋白质是根据蛋白质在电场中的电泳分别蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移率迁移率1.5蛋白质的一级构培育是蛋白质的氨基酸序列蛋白质的一级构培育是蛋白质的氨基酸序列 1.5.1蛋白质的氨基酸组成可以定量确定蛋白质的氨基酸组成可以定量确定 1.5.2 Edman降解方法常用于氨基酸序列的测降解方法常用于氨基酸序列的测定定 1.5.3大蛋白被水解成肽段后再测序大蛋白被水解成肽段后再测序 1.5.4蛋白质一级构造的比较可以提示进化关蛋白质一级构造的比较可以提示进化关系系1.1 蛋白质是由二十种不同的氨基酸构成的蛋白质是由二

3、十种不同的氨基酸构成的 蛋白质是由氨基酸构成的聚合物，一切生物都是利用这蛋白质是由氨基酸构成的聚合物，一切生物都是利用这20种氨基酸作为构件组装成各种蛋白质分子的。因此这种氨基酸作为构件组装成各种蛋白质分子的。因此这20种氨种氨基酸被以为是通用的或是规范的氨基酸。虽然氨基酸的种类基酸被以为是通用的或是规范的氨基酸。虽然氨基酸的种类有限，但由于氨基酸在蛋白质中衔接的次序以及氨基酸数目有限，但由于氨基酸在蛋白质中衔接的次序以及氨基酸数目的不同，所以可以组装成几乎无限的不同种类的蛋白质。的不同，所以可以组装成几乎无限的不同种类的蛋白质。20种氨基酸都被称之种氨基酸都被称之-氨基酸，由于氨基酸，由于-

4、氨基酸分子中的氨基酸分子中的-碳分子中第碳分子中第2个碳，个碳，C结合着一个氨基和一个酸性的羧结合着一个氨基和一个酸性的羧基，此外基，此外C还结合着一个还结合着一个H原子和一个侧链基团用原子和一个侧链基团用R表表示。每一种氨基酸的示。每一种氨基酸的R都是不同的，侧链上的碳依次按字母都是不同的，侧链上的碳依次按字母命名为命名为、和和碳，分别指的是第碳，分别指的是第3、4、5和和6位碳。位碳。 表1.1 20种规范氨基酸的英文称号及简写符号中文名称英文名称三字母缩写单字母符号甘氨酸GlycineGlyG丙氨酸AlanineAlaA缬氨酸ValineValV亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸Iso

5、leucineIleI脯氨酸ProlineProP苯丙氨酸PhenylalaninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW丝氨酸SerineSerS苏氨酸ThreonineThrT半胱氨酸CystineCysC蛋氨酸MethionineMetM天冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酰胺GlutarnineGlnQ天冬氨酸Aspartic acidAspD谷氨酸Glutamic acidGluE赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组氨酸HistidineHisH1.1.1 20种规范氨基酸可以按其侧链分类种规范氨基酸可以按其侧链分类 20种

6、氨基酸按照它们的侧链基团可以分为：种氨基酸按照它们的侧链基团可以分为：6种脂肪族、种脂肪族、3种芳香族、种芳香族、2种种含硫、含硫、2种羟基、种羟基、3种碱性、种碱性、2种酸性和种酸性和2种酰胺氨基酸。种酰胺氨基酸。1、R为脂肪族基团的氨基酸为脂肪族基团的氨基酸 甘氨酸的构造在甘氨酸的构造在20种氨基酸中最简单，由于它的侧链是个氢原子，所以甘种氨基酸中最简单，由于它的侧链是个氢原子，所以甘氨酸的氨酸的-碳不是手性碳。丙氨酸碳不是手性碳。丙氨酸-氨基丙酸的侧链是一个简单的甲基；氨基丙酸的侧链是一个简单的甲基；缬氨酸缬氨酸-氨基异戊酸的侧链是一个含有支链的氨基异戊酸的侧链是一个含有支链的3碳侧链；

7、亮氨酸碳侧链；亮氨酸-氨基异己酸和异亮氨酸氨基异己酸和异亮氨酸-氨基氨基-甲基戊酸都是含有支链的甲基戊酸都是含有支链的4碳侧链。碳侧链。要留意的是，异亮氨酸分子中的要留意的是，异亮氨酸分子中的-碳和碳和-碳都是不对称碳。所以异亮氨酸碳都是不对称碳。所以异亮氨酸存在着存在着4种能够的立体异构体：种能够的立体异构体：L-异亮氨酸，异亮氨酸， D-异亮氨酸，异亮氨酸，L-别构异亮氨酸，别构异亮氨酸，和和D-别构异亮氨酸别构是指一个异构方式，别构异亮氨酸别构是指一个异构方式，脯氨酸脯氨酸-吡咯烷基吡咯烷基-羧酸明显地不同于其它羧酸明显地不同于其它19种氨基酸，它有一个环种氨基酸，它有一个环形的饱和烃侧

8、链，结合在形的饱和烃侧链，结合在-氨基的氮和氨基的氮和-碳上。所以严厉地讲，脯氨酸是碳上。所以严厉地讲，脯氨酸是一个亚氨基酸，由于它含有一个二级氨基，而不是一级氨基。不过在蛋白质一个亚氨基酸，由于它含有一个二级氨基，而不是一级氨基。不过在蛋白质中发现的脯氨酸也象其它氨基酸一样，它的中发现的脯氨酸也象其它氨基酸一样，它的-碳也是手性碳。脯氨酸的杂碳也是手性碳。脯氨酸的杂环吡咯烷环限制多肽的几何构型，有时会在多肽链中引进一个转机的变化。环吡咯烷环限制多肽的几何构型，有时会在多肽链中引进一个转机的变化。2、R为芳香族基团的氨基酸为芳香族基团的氨基酸 苯丙氨酸苯丙氨酸-氨基氨基-苯丙酸是一个含有苯基的

9、氨基酸。酪氨酸苯丙酸是一个含有苯基的氨基酸。酪氨酸-氨基氨基-对羟基苯丙酸的构造类似于苯丙氨酸，称之对羟基苯丙氨酸。对羟基苯丙酸的构造类似于苯丙氨酸，称之对羟基苯丙氨酸。酚是个比较弱的酸，所以酪氨酸侧链的酚是个比较弱的酸，所以酪氨酸侧链的pKa值为值为10.5。色氨酸。色氨酸-吲哚吲哚-氨基丙酸的侧链带有一个双环的吲哚基，所以色氨酸又称之吲哚丙氨基丙酸的侧链带有一个双环的吲哚基，所以色氨酸又称之吲哚丙氨酸。三种芳香族氨基酸都吸收紫外光，在中性氨酸。三种芳香族氨基酸都吸收紫外光，在中性pH条件下，色氨酸和酪条件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在，而苯丙氨

10、酸的在260nm，大多数蛋白质中都，大多数蛋白质中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的一种，所以溶液中含有色氨酸和酪氨酸或其中的一种，所以溶液中280nm吸收的丈量常用来吸收的丈量常用来估算蛋白质的浓度。估算蛋白质的浓度。3、R为含硫基团的氨基酸为含硫基团的氨基酸 蛋氨酸和半胱氨酸是两个含硫氨基酸。蛋氨酸蛋氨酸和半胱氨酸是两个含硫氨基酸。蛋氨酸-氨基氨基-甲硫基丁酸甲硫基丁酸是个疏水氨基酸，它的侧链上带有一个非极性的甲基硫醚基，不过其中的是个疏水氨基酸，它的侧链上带有一个非极性的甲基硫醚基，不过其中的硫原子是亲核的。半胱氨酸硫原子是亲核的。半胱氨酸-氨基氨基-巯基丙酸侧链上含有一个巯基巯基丙酸侧链上含

11、有一个巯基-SH，所以又称之巯基丙氨酸。虽然半胱氨酸的侧链显得有点疏水性，所以又称之巯基丙氨酸。虽然半胱氨酸的侧链显得有点疏水性，但但-SH也是一个高反响性的基团。也是一个高反响性的基团。4、R为含醇基基团的氨基酸为含醇基基团的氨基酸 丝氨酸和苏氨酸是两个侧链含有丝氨酸和苏氨酸是两个侧链含有-羟基的不带电荷的氨基酸：羟基的不带电荷的氨基酸：苏氨酸苏氨酸-氨基氨基-羟基丙酸、丝氨酸羟基丙酸、丝氨酸-氨基氨基-羟基丁酸。羟基丁酸。虽然丝氨酸的羟甲基虽然丝氨酸的羟甲基-CH2OH在水溶液看不出离子化，但这在水溶液看不出离子化，但这个醇可以参与很多酶的活性部位反响，就象已被离子化了一样。个醇可以参与很

12、多酶的活性部位反响，就象已被离子化了一样。要留意，苏氨酸也象异亮氨酸一样，具有两个手性碳原子，即要留意，苏氨酸也象异亮氨酸一样，具有两个手性碳原子，即-碳和碳和-碳原子，通常出如今蛋白质中的碳原子，通常出如今蛋白质中的L-苏氨酸只是苏氨酸只是4种立体种立体异构体中的一种，异构体中的一种，5、R为碱性基团的氨基酸为碱性基团的氨基酸 有有5种氨基酸在种氨基酸在pH7时它们的侧链基团带有电荷，其中有时它们的侧链基团带有电荷，其中有3种是种是带正电荷的碱性带正电荷的碱性R基团，另外基团，另外2种是带负电荷的酸性种是带负电荷的酸性R基团。组氨基团。组氨酸、赖氨酸和精氨酸它们都带有亲水性的含氮碱基酸、赖氨

13、酸和精氨酸它们都带有亲水性的含氮碱基R基团。组氨基团。组氨酸酸-氨基氨基-咪唑基丙酸的侧链有一个咪唑环，所以又称之咪唑基丙酸的侧链有一个咪唑环，所以又称之咪唑丙氨酸。咪唑基是可以离子化的咪唑丙氨酸。咪唑基是可以离子化的pKa6.0。赖氨酸。赖氨酸,-二氨基己酸是一个双氨基酸，含有二氨基己酸是一个双氨基酸，含有-和和-氨基。在氨基。在中性中性pH，-氨基是以碱性氨离子氨基是以碱性氨离子-CH2-NH3方式存在的，方式存在的，在蛋白质中通常带正电荷。精氨酸在蛋白质中通常带正电荷。精氨酸-氨基氨基-胍基戊酸是胍基戊酸是20种氨基酸中碱性最强的氨基酸，它的侧链胍基离子的种氨基酸中碱性最强的氨基酸，它的

14、侧链胍基离子的pKa值最高值最高pKa12.5。6、R为酸性基团的氨基酸为酸性基团的氨基酸 天冬氨酸天冬氨酸-氨基丁二酸和谷氨酸氨基丁二酸和谷氨酸-氨基戊二酸是二羧基氨基酸，氨基戊二酸是二羧基氨基酸，除了含有除了含有-羧基外，天冬氨酸还含有羧基外，天冬氨酸还含有-羧基，谷氨酸还含有羧基，谷氨酸还含有-羧基。由羧基。由于两个氨基酸的侧链在于两个氨基酸的侧链在pH7时都离子化了，所以在蛋白质中是带负电荷的，时都离子化了，所以在蛋白质中是带负电荷的，这两个氨基酸经常出如今蛋白质分子外表上，谷氨酸的单钠盐是调味品味精。这两个氨基酸经常出如今蛋白质分子外表上，谷氨酸的单钠盐是调味品味精。7、R为含酰胺基

15、团的氨基酸为含酰胺基团的氨基酸 天冬酰胺天冬酰胺-氨基氨基-羧基丙酰胺和谷氨酰胺羧基丙酰胺和谷氨酰胺-氨基氨基-羧基丁酰胺羧基丁酰胺分别是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺化产物。虽然这两个氨基酸的侧链是不带电分别是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺化产物。虽然这两个氨基酸的侧链是不带电荷的，但它们的极性很强，也经常出如今蛋白质分子的外表，它们可以和水荷的，但它们的极性很强，也经常出如今蛋白质分子的外表，它们可以和水相互作用。另外这两种氨基酸的酰胺基可以与其它的极性氨基酸的侧链上的相互作用。另外这两种氨基酸的酰胺基可以与其它的极性氨基酸的侧链上的原子构成氢键。原子构成氢键。必需和非必需氨基酸：必需和非必需氨基酸： 以

16、上氨基酸分类完全是根据侧链的性质分类的，从营养学角度又可将氨以上氨基酸分类完全是根据侧链的性质分类的，从营养学角度又可将氨基酸分为必需和非必需氨基酸。必需氨基酸包括赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、基酸分为必需和非必需氨基酸。必需氨基酸包括赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和精氨酸，其中组氨亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和精氨酸，其中组氨酸和精氨酸，人虽然能合成，但效率低，尤其在婴幼儿时期，需求由外界供酸和精氨酸，人虽然能合成，但效率低，尤其在婴幼儿时期，需求由外界供应。非必需氨基酸是其他的应。非必需氨基酸是其他的10种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、

17、半胱氨酸、酪氨种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和丙氨酸。酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和丙氨酸。1.1.2氨基酸的离子形状取决于环境的氨基酸的离子形状取决于环境的pH 表表1.2 给出了给出了25下游离氨基酸的酸性和碱性基团的下游离氨基酸的酸性和碱性基团的pKa值和氨基酸的等电点值和氨基酸的等电点pI。氨基酸分子量-COOHpKa-NH3+R 基团pI蛋白质中出现的几率 (%)*甘氨酸752.349.605.977.5丙氨酸892.349.696.019.0缬氨酸1172.329.625.976.9亮氨酸1312.369

18、.605.987.5异亮氨酸1312.369.686.024.6脯氨酸1151.9910.966.484.6苯丙氨酸1651.839.135.483.5酪氨酸1812.209.1110.075.663.5色氨酸2042.389.395.891.1丝氨酸1052.219.155.687.1苏氨酸1192.119.625.876.0半胱氨酸1211.968.1810.285.052.8蛋氨酸1492.289.215.741.7天冬酰胺1322.028.805.414.4谷氨酰胺1462.179.135.653.9天冬氨酸1331.889.603.652.775.5谷氨酸1472.199.674.2

19、53.226.2赖氨酸1462.188.9510.539.747.0精氨酸1742.179.0412.4810.764.7组氨酸1551.829.176.007.592.1* 在 200 多种蛋白质中出现的平均几率。氨基酸的-COOH基是个弱酸，利用Henderson-Hasselbalch方程可以计算任何pH下离子化基团的比例。 共轭碱pHpKalog 弱酸从表1.2可以看出，游离氨基酸的-COOH的pKa值的范围是1.8至2.5。对于一个典型的氨基酸它的-COOH的pKa值大约是2，羧酸盐对羧酸的比是100000 :1，所以在中性pH条件下，占优势的成分是羧酸盐离子。 RCOO7.02.0

20、log RCOOH-氨基的pKa值的范围是8.7至10.7。它的共轭碱游离的胺-NH2对共轭酸质子化的胺-NH3的比，在pH7时为1:1000。计算阐明，在中性pH条件下，游离氨基酸主要是以兼性离子方式存在的。所以将一个氨基酸画成带有-COOH和-NH2基团的方式是不适宜的。由于不存在这样一种pH，即在这一pH下，-COOH和-NH2都占优势。脯氨酸的氨基pKa10.6在中性pH条件下也是质子化的碱基方式，虽然侧链与-氨基结合，脯氨酸在pH7时仍是一种兼性离子。 经过氨基酸的滴定曲线可以确定氨基酸的各个解离基团的pKa值。图1.4给出了丙氨酸和组氨酸的滴定曲线。丙氨酸有两个可解离基团，-COO

21、H和-NH3，它们的pKa值分别是2.4和9.9，每一个值都是位于滴定曲线缓冲区的中心。组氨酸有3个可解离基团，即-COOH、-NH3和侧链基团咪唑基，pKa值分别是1.8、6.0和9.3，也都是处于缓冲区的中心。1.1.3 运用离子交换层析可将各种氨基酸分开运用离子交换层析可将各种氨基酸分开 层析层析chromatography也称之色谱来自也称之色谱来自Chroma，其，其根本原理是分析样品作为流动相流过固相时，样品中的各个成根本原理是分析样品作为流动相流过固相时，样品中的各个成分与固相进展着不同程度的相互作用，使得样品中的各个成分分与固相进展着不同程度的相互作用，使得样品中的各个成分在固

22、相中的迁移率产生了差别，从而到达分别样品的目的。在固相中的迁移率产生了差别，从而到达分别样品的目的。 根据固相与样品中各个成分之间相互作用的种类的不同，又根据固相与样品中各个成分之间相互作用的种类的不同，又有离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析方法。通有离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析方法。通常都是将固相装到一个柱子里，然后使流动相流过柱子有时常都是将固相装到一个柱子里，然后使流动相流过柱子有时需求加压力，这样的层析方法叫做柱层析需求加压力，这样的层析方法叫做柱层析column chromatography。 假设被分别的样品中各个成分受溶液假设被分别的样品中各个成分受溶液

23、pH的影响，有时带正电的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进展样品荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进展样品的分别。离子交换层析的固相是离子交换体，其中有离子交换的分别。离子交换层析的固相是离子交换体，其中有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。通常是以树脂、或树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。通常是以树脂、或是纤维素、或是葡聚糖作为基质，这些基质具有网状构造，将是纤维素、或是葡聚糖作为基质，这些基质具有网状构造，将带电基团引入到基质上带电基团引入到基质上托纬闪死胱咏换皇髦托纬闪死胱咏换皇髦菀菀氲拇氲拇缁缁挪煌挪煌址治址治衾胱咏换惶搴鸵趵胱咏

24、换惶濉衾胱咏换惶搴鸵趵胱咏换惶濉 引入引入SO3Na 或或COOH基团的叫做阳离子交换体；引入基团的叫做阳离子交换体；引入NC2H5Cl基团的叫做阴离子交换体。基团的叫做阴离子交换体。 分别氨基酸常用的是带有耐酸性非常强的磺酸根SO3Na以盐的方式出现的强阳离子交换树脂。首先将这种树脂填充到柱子中，然后注入含有样品的流动相，样品中含有阳离子成分X，经过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果X与Na交换，即发生阳离子交换后，构成SO3X。1.1.4 氨基酸可进展特征的化学反响氨基酸可进展特征的化学反响 氨基酸的氨基酸的-氨基、氨基、-羧基以及氨基酸的各种侧链基团可进展羧基以及氨基酸的各种侧链

25、基团可进展很多种化学反响。氨基酸与茚三酮很多种化学反响。氨基酸与茚三酮ninhydrin的反响是一个的反响是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反响。茚三酮在弱酸性溶液检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反响。茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，一切具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合中与氨基酸共热，一切具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物物470图图1.7。然而由于脯氨酸是一个亚氨基酸，所。然而由于脯氨酸是一个亚氨基酸，所以与茚三酮反响生成的是黄色化合物以与茚三酮反响生成的是黄色化合物440。 有几种与氨基酸的氨基反响的试剂常用来鉴定蛋白质和多肽的N-末端氨基酸残基。 2,4-二硝基氟苯2,4-dini

26、trofluorobenzene, DNFB也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反响，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸图1.8a。丹磺酰氯丹磺酰氯dansyl chloride是是5-二甲基氨基萘二甲基氨基萘-1-磺酰氯磺酰氯5-dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride的简称。丹磺酰氯与的简称。丹磺酰氯与氨基酸反响生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物图氨基酸反响生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物图1.8b，也常用，也常用于多肽链的于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。末

27、端氨基酸的鉴定。 苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯phenylisothiocyanate, PITC在弱碱性条件下，与氨在弱碱性条件下，与氨基酸反响生成苯乙内酰硫脲基酸反响生成苯乙内酰硫脲phenylthiohydantoin, PTH衍生物，即衍生物，即PTH-氨基酸图氨基酸图1.8c，此反响又称之，此反响又称之Edman反响，该反响是蛋白质或反响，该反响是蛋白质或多肽氨基酸序列测定常用的反响。多肽氨基酸序列测定常用的反响。1.2蛋白质中的氨基酸是经过肽键衔接的蛋白质中的氨基酸是经过肽键衔接的 一个氨基酸的一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的-氨基缩合，经过构氨基缩合，经过构成的

28、酰胺键将两个氨基酸衔接在一同，这个酰胺键称之肽键成的酰胺键将两个氨基酸衔接在一同，这个酰胺键称之肽键peptide bond图图1.9，氨基酸缩合生成的产物称之肽，氨基酸缩合生成的产物称之肽peptide。1.3肽可以化学合成肽可以化学合成 多肽合成的根本过程是本世纪初由多肽合成的根本过程是本世纪初由Emil Fischer设计的，称为液设计的，称为液相合成法，肽链从相合成法，肽链从N端向端向C端方向延伸。首先一个氨基酸的羧基和端方向延伸。首先一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基被维护基团封锁，然后参与肽键构成的羧基被另一个氨基酸的氨基被维护基团封锁，然后参与肽键构成的羧基被激活，如构成脂酰氯

29、，或酸酐。激活的羧酸遭到游离氨基的亲电攻激活，如构成脂酰氯，或酸酐。激活的羧酸遭到游离氨基的亲电攻击构成一个封锁的二肽图击构成一个封锁的二肽图1.11。最后经过水解有选择地除去维。最后经过水解有选择地除去维护基团而留下一个完好的肽键。护基团而留下一个完好的肽键。1.4蛋白质可以经过各种生物化学技术纯化蛋白质可以经过各种生物化学技术纯化利用蛋白质的溶解度、净电荷、大小以及与配体结合特异性上利用蛋白质的溶解度、净电荷、大小以及与配体结合特异性上的微小差别。有透析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、的微小差别。有透析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、电泳垂直板电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等分别纯化

30、方电泳垂直板电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等分别纯化方法。透析法。透析离子交换层析离子交换层析 离子交换层析同样可以用于蛋白质的分别纯化。由于离子交换层析同样可以用于蛋白质的分别纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其条件下，其带电情况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋带电情况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后经过提高洗白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后经过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗

31、脱下来。下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。凝胶过滤层析凝胶过滤层析Gel-filtration chromatography 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进展分别的技术，凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进展分别的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象个本身象个“筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。C 亲和层析亲和层析Affinity chromatography 这是一种最有选择性的柱层析，其原理是依赖于蛋白质和这是一种最有选择性的柱层析，其原理是依赖于蛋白质和它的配体它的配体liga

32、nd之间的相互作用来分别的。配体通常指之间的相互作用来分别的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合普通是非共价结合的分的是能与另一个分子或原子结合普通是非共价结合的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是经过共子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是经过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反响物或产物，价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反响物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物经过装有或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物经过装有衔接了配体的基质的亲和层析柱时，只需靶蛋白可以特异地衔接了配体的基质的亲和层析柱时，只需靶蛋白可以特异地与基质结合，

33、而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度的自在配体异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度的自在配体的溶剂。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高的溶剂。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至至10000倍。倍。1.4.2电泳分别蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移率电泳分别蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移率 电泳分别蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别到电泳分别蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别到达分别目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，达分别目的的。蛋白质样品加到

34、一块预先制好的凝胶介质上，只需在凝胶的两端加上电场，就可以到达分别蛋白质的目的，只需在凝胶的两端加上电场，就可以到达分别蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳这样的电泳称之凝胶电泳gel electrophoresis。凝胶可以。凝胶可以是淀粉凝胶是淀粉凝胶starch gel、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶agarose gel和聚和聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺凝胶polyacrylamide gel。普通凝胶介质中的。普通凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和这样它们可以向阳极

35、迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关，我们引见其中常用的几种主要的电泳技带电荷的多少有关，我们引见其中常用的几种主要的电泳技术。术。A SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE 运用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠sodium dodecyl sulfate, SDS和复原剂通常为巯基乙醇的样品处置液对蛋白质样品进展处置普通煮沸35分钟，经过加热和SDS可以使蛋白量变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时复原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键使二硫键复原。经过这样处置的样品中的肽链都是处于无二硫键衔接的

36、，分别的形状。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS经过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。B 等电聚焦电泳等电聚焦电泳Isoelectric focusing electrophoresis, IFE 等电聚焦电泳是一种电泳的改良技术，实践上是利用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳是一种电泳的改良技术，实践上是利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称度。所用的缓

37、冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质之两性电解质ampholytes。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的相一致的pH处图处图1.18，具，具有不同有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，到达分别处，到达分别的目的。的目的。C 双向电泳双向电泳two-dimensional electrophoresis 假设将等电聚焦电泳与假设将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是分辨率更高的结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳

38、了图一种双向电泳了图1.19。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，程度方向反映出蛋白在维分布图，程度方向反映出蛋白在pI上的差别，而垂直方向反映出上的差别，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量一样而等电点它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量一样而等电点不同的蛋白质以及等电点一样而分子量不同的蛋白质分开。不同的蛋白质以及等电点一样而分子量不同的蛋白质分开。1.5蛋白质一级构培育是它的氨基酸序列蛋白质一级构培育是它的氨基酸序列 从从1953年年Sanger测定了胰岛素的全部氨基酸序列。每一种蛋测定了胰岛素的全部氨基酸序列。

39、每一种蛋白质都具有独一的氨基酸序列。实践上蛋白质的氨基酸序列是白质都具有独一的氨基酸序列。实践上蛋白质的氨基酸序列是由由DNA决议的。测定蛋白质的氨基酸序列具有重要意义，第决议的。测定蛋白质的氨基酸序列具有重要意义，第一，测定蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子根一，测定蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子根底。其次，研讨阐明蛋白质的一级构造决议它的空间构造。第底。其次，研讨阐明蛋白质的一级构造决议它的空间构造。第三，氨基酸序列的改动可以产生异常功能和疾病，例如致命的三，氨基酸序列的改动可以产生异常功能和疾病，例如致命的镰刀形红细胞贫血病。因此序列测定成为分子病理学的一个部镰刀

40、形红细胞贫血病。因此序列测定成为分子病理学的一个部分。最后蛋白质的氨基酸序列能指明它的进化史。分。最后蛋白质的氨基酸序列能指明它的进化史。1.5.1蛋白质的氨基酸组成可以定量确定蛋白质的氨基酸组成可以定量确定 首先经过酸水解破坏蛋白质的肽键，典型酸水解的条件是：真首先经过酸水解破坏蛋白质的肽键，典型酸水解的条件是：真空条件下，空条件下，110，用，用6M盐酸水解盐酸水解16至至72小时。水解的混合物水小时。水解的混合物水解液进展柱层析，经过柱层析可以将水解液中的每一个氨基酸分解液进展柱层析，经过柱层析可以将水解液中的每一个氨基酸分别出来并被定量，这一过程称之氨基酸分析别出来并被定量，这一过程称

41、之氨基酸分析amino acid analysis。其中一种氨基酸分析方法是用苯异硫氰酸酯。其中一种氨基酸分析方法是用苯异硫氰酸酯PITC处置蛋白质水解液处置蛋白质水解液pH9，生成苯硫脲，生成苯硫脲PTC-氨基酸衍生物，氨基酸衍生物，PTC-氨基酸混合物经氨基酸混合物经HPLC细硅胶柱，按照它们的疏水特性被细硅胶柱，按照它们的疏水特性被分别。分别的每个分别。分别的每个PTC-氨基酸经丈量氨基酸经丈量254nmPTC-氨基酸吸收峰氨基酸吸收峰波长光吸收，确定它们的浓度。图波长光吸收，确定它们的浓度。图1.20给出了给出了PTC-氨基酸混合物氨基酸混合物HPLC的洗脱图，图中的峰用各个氨基酸的吸

42、收峰，用规范的单个的洗脱图，图中的峰用各个氨基酸的吸收峰，用规范的单个字母表示。由于存在于水解液中每个氨基酸的量是与洗脱峰的面积字母表示。由于存在于水解液中每个氨基酸的量是与洗脱峰的面积成比例的。成比例的。1.5.2 Edman降解方法常用于氨基酸序列的测定降解方法常用于氨基酸序列的测定 P. Edman降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。个过程。首先运用苯异硫氰酸酯首先运用苯异硫氰酸酯PITC在在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或的碱性条件下对蛋白质或多肽进展处置，多肽进展处置，PITC与肽链的与肽链的N-端的氨基酸残基反响，构成苯氨端的氨

43、基酸残基反响，构成苯氨基硫甲酰基硫甲酰PTC衍生物，即衍生物，即PTC-肽。然后肽。然后PTC-肽用三氟乙酸处肽用三氟乙酸处置，置，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂例如氯丁烷噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂例如氯丁烷从反响液中萃取出来，而去掉了一个从反响液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，构成一个

44、稳定的苯乙内酰硫脲步环化，构成一个稳定的苯乙内酰硫脲PTH衍生物，即衍生物，即PTH-氨基酸图氨基酸图1.21。1.5.4蛋白质一级构造的比较可以提示进化关系蛋白质一级构造的比较可以提示进化关系 蛋白质一级构造是由编码它的基因确定的，蛋白质一级构造蛋白质一级构造是由编码它的基因确定的，蛋白质一级构造之间的差别可以反映出进化关系。来自亲缘关系亲密的蛋白质之间的差别可以反映出进化关系。来自亲缘关系亲密的蛋白质的氨基酸序列非常类似，一级构造中氨基酸残基序列差别越大，的氨基酸序列非常类似，一级构造中氨基酸残基序列差别越大，反映出它们的亲缘关系就较远。细胞色素反映出它们的亲缘关系就较远。细胞色素c是由一条含有是由一条含有104至至111个氨基酸残基的多肽链组成的，由于细胞色素个氨基酸残基的多肽链组成的，由于细胞色素c几乎存在于几乎存在于一切的需氧生物中，