荧光定量PCR技术检测黑素瘤BRAF基因突变

1、荧光定量荧光定量PCR技术检测黑素瘤技术检测黑素瘤BRAF基因突变基因突变重庆市中医院（重庆市第一人民医院）重庆市中医院（重庆市第一人民医院）皮皮 肤肤 科科龙富波龙富波2014-5-29目录 黑色素瘤概况 BRAF基因与黑色素瘤 实时荧光定量PCR检测BRAF突变 BRAF基因检测对于黑色素瘤的意义黑色素瘤概况黑色素瘤概况 恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为35。2010年全球黑色素瘤新发病例199 627例，死亡例数为46372例1。 虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例1。1CS

2、CO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期BRAF基因与黑色素瘤基因与黑色素瘤 检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9其中BRAFV600E是最常见的突变位点(87)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提供了理论基础1。 在103个治疗中心共入组了675例不能手术切除的期或期的初治黑色素瘤患者，结果Vemurafenib组的客观有效率客观有效率达到达到48而达卡巴嗪(DTIC)组仅5.5，故在指南中也将Vemurafenib作为BRAFV600E 突变患者的一类证据推荐。1CSCO黑

3、色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版) 临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期丝裂原活化蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶( MAPK) 信号转导通路信号转导通路 该通路在细胞的生长、分化和增殖中起着重要作用，通路通过 as、af、有丝分裂原活化蛋白激酶( MEK)及胞外信号调节激酶( EK) 的特异性级联磷酸化将信号由细胞外传入细胞核内2。2董高超，周 湘，唐伟方，陆 涛.B-af 激酶抑制剂的研究进展J中国药科大学学报2014，45( 1) : 1 9.BRAF基因基因 RAF激酶家族有3个亚型: ARAF、BRAF和CRAF。这 3 个亚型均有 3 个保守区域 CR)：CR1、

4、CR2 和 CR3。 研究表明BRAFV600E的催化活性比野生型野生型 B-af 活性活性高高 500 倍倍33Wan PTC，Garnett MJ，oe SM，et al Mechanism of activation ofthe AF-EK signaling pathway by oncogenic mutations ofB-AFJ Cell，2004，116( 6) : 855 867.ARMS引物只和突变位点结合，然后Taq DNA多聚酶启动PCR反应ARMS引物不与野生型靶DNA结合，因而Taq DNA多聚酶无法启动PCR反应扩增阻碍突变系统扩增阻碍突变系统PCR原理原理引物与

5、探针结合区的上游序列结合 引物延伸复制的区域与探针区互补 阻止基团使DNA多聚酶不能复制探针区随着温度升高，引物延伸序列变性温度降低，引物延伸序列内部杂交荧光基团远离淬灭基团开始有荧光信号未延伸引物则退火，荧光信号被淬灭实时荧光定量实时荧光定量PCR检测检测BRAF突变步骤突变步骤 第一步：石蜡组织切片DNA提取 第二步：样品评估 第三步：样品检测石蜡组织中石蜡组织中DNA提取提取1.石蜡组织切片收集及鉴定2.组织切片刮取3.加热裂解消化DNA4.去除石蜡5.吸附柱收集DNA实时荧光定量实时荧光定量PCR质量监控质量监控1、样本、样本DNA评估评估体系: 加入5l样本，BRAF positiv

6、e control以及无酶水（NTC）DNA样品质量结果分析样品质量结果分析 1) NTC在在FAM通道的通道的Ct值小于值小于40表示有污染；表示有污染；2) BRAF positive control (PC)在在FAM通道的通道的Ct值必须在值必须在27.82-33.8527.82-33.85之间，如果不在之间，如果不在这个范围，说明设置有误；这个范围，说明设置有误；3) 在在BRAF positive control和和NTC都满足要求的情况下，样本都满足要求的情况下，样本FAM通道通道Ct值必须在值必须在20.95-33.0020.95-33.00之间；之间；4) 样本样本FAM通道

7、通道Ct值小于值小于20.9520.95，即使是非常接近，即使是非常接近20.9520.95，样本必须稀释至，样本必须稀释至Ct值在值在20.95-33.0020.95-33.00之间，可以按照每稀释两倍之间，可以按照每稀释两倍Ct值增加值增加1计算计算；检测检测BRAF突变突变体系：加入待测5l样本，BRAF positive control以及无酶水（NTC） NTC在在FAM通道的通道的Ct值小于值小于40表示有污染表示有污染BRAF positive control (PC)在在FM通道的通道的Ct值必须在值必须在27.82-33.85之间之间A样本分析样本分析mutation Ct control Ct = Ct检测的意义检测的意义 对病理确诊黑色素瘤的患者进行BRAF突变检测对于指导临床用药十分必要。实时荧光定量PCR法（TaqMan）是目前检测基因突变最有效的方法之一，可以在同一试管完成DNA扩增