基因工程研究生11

1、目目 录录高等教育出版社高等教育出版社南昌大学医学院南昌大学医学院万福生万福生 Genetic Engineering基因工程基因工程1目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n基因工程（基因工程（genetic engineeringgenetic engineering）是人们）是人们在对自然界基因重组和基因转移的认识上在对自然界基因重组和基因转移的认识上发展起来的一门分子生物学技术。发展起来的一门分子生物学技术。n基因工程的重要特点是在分子水平上操作，基因工程的重要特点是在分子水平上操作，细胞水平上表达。细胞水平上表达。n它的诞生和发展，不但为生命科学的理论它的诞生和发展，不但为生命科学的

2、理论研究提供了崭新的技术手段，而且为医学研究提供了崭新的技术手段，而且为医学领域的发展开辟了广阔的前景。领域的发展开辟了广阔的前景。 2目目 录录高等教育出版社高等教育出版社生物技术工程生物技术工程: : 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工

3、艺学工艺学。3目目 录录高等教育出版社高等教育出版社第 一 部分DNA的重组 DNA Recombination4目目 录录高等教育出版社高等教育出版社DNA重组重组接合作用接合作用 (conjugation)转化作用转化作用 (transformation)转导作用转导作用 (transduction)转转 座座 (transposition)同源重组同源重组 (homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)5目目 录录高等教育出版社高等教育出版社发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源

4、重组同源重组(homologous recombination)，又称又称基本重组基本重组。是最基本的是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。链或双链片段的交换。 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组的同源重组为例，了解同源重组机制的机制的Holliday模型。模型。一、同源重组一、同源重组6目目 录录高等教育出版社高等教育出版社Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Hol

5、liday中间体通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 7目目 录录高等教育出版社高等教育出版社片段重组体片段重组体 （见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体拼接重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体

6、异源切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本双链区的两侧来自不同亲本DNA。 8目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 目目 录录9目目 录录高等教育出版社高等教育出版社Holiday中间体中间体5 3 5 3 5

7、3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目目 录录10目目 录录高等教育出版社高等教育出版社二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）（一）接合作用接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的另一细胞（细

8、菌）的DNA转移称为转移称为接合作用接合作用(conjugation)。11目目 录录高等教育出版社高等教育出版社可接合质粒可接合质粒如如 F 因子因子(F factor) 质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子12目目 录录高等教育出版社高等教育出版社（二）（二）转化作用转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为称为转化作用转化作用 (transformation)。 13目目 录录高等教育出版社高等教育出版社例例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解

9、的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。14目目 录录高等教育出版社高等教育出版社目目 录录15目目 录录高等教育出版社高等教育出版社（三）（三）转导作用转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因转移及基因重组即为重组即为转导作用转导作用(transduction)。16目目 录录高等教育出版社高等教育出版社噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途

10、径(lysogenic pathway)例例目目 录录17目目 录录高等教育出版社高等教育出版社目目 录录18目目 录录高等教育出版社高等教育出版社三、位点特异重组三、位点特异重组位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点序列的特异位点间发生的整合。间发生的整合。例例 （一）一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒毒整

11、合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 19目目 录录高等教育出版社高等教育出版社例例（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变 20目目 录录高等教育出版社高等教育出版社hix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H片片段可在段可在Hin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P，其一驱动其一驱动hin基因基因表达，另一正向时驱动表达，另一正向时驱动H2和和rH1基因

12、表达，基因表达，反向反向(倒位倒位)时时H2和和rH1不表达。不表达。rH1为为H1的的阻遏蛋白基因。阻遏蛋白基因。21目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变22目目 录录高等教育出版社高等教育出版社例例（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链由两条轻链(L链链)和两和两条重链条重链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族组

13、成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链编码，其中两个编码轻链( 和和 )，一个编码，一个编码重链。重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 23目目 录录高等教育出版社高等教育出版社重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基因的基因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧均片段的两侧均存在保守的重组信号序列存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此

14、重排的重组酶基因此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，共有两个，分别产生蛋白质分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段24目目 录录高等教育出版社高等教育出版社V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程目目 录录25目目 录录高等教育出版社高等

15、教育出版社四、四、转座转座重组重组由插入序列和转座子介导的基因移位或由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为重排称为转座转座(transposition)。26目目 录录高等教育出版社高等教育出版社插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 IRTransposase GeneIR发生形式：发生形式：保守性转座保守性转座(conservative transpositi

16、on)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)（一）插入序列转座（一）插入序列转座27目目 录录高等教育出版社高等教育出版社插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目目 录录28目目 录录高等教育出版社高等教育出版社转座子转座子(transposons) 可从一个染色体位可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座29

17、目目 录录高等教育出版社高等教育出版社30目目 录录高等教育出版社高等教育出版社由转座子介导的转座由转座子介导的转座目目 录录31目目 录录高等教育出版社高等教育出版社第 二 部分 重组DNA技术DNA Recombination Technique 32目目 录录高等教育出版社高等教育出版社克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆33目目 录录高等教育出版社高等教育出版社技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(mol

18、ecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）34目目 录录高等教育出版社高等教育出版社DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）与载体与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同

19、一的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一D N A 分 子 ， 也 称分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D N A (recombinant DNA) 。 35目目 录录高等教育出版社高等教育出版社重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验18661944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界

20、上第一第一家家遗传工程公司，专门应用重组遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学技术制造医学上重要的药物。上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛技术生产胰岛素的工厂素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉。36目目 录录高等教育出版社高等教育出版社第二节第二节 基因工程的物质基础基因工程的物质基础 第三节第三节 基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程第四节第四节 克隆基因的表达克隆基因的表达 第五节第五节 基因工程技术与医学的发展基因工程技术与医学的发展 第一节第一节 基因工程的基本原理基因工程的

21、基本原理 37目目 录录高等教育出版社高等教育出版社第一节第一节 基因工程的基本原理基因工程的基本原理 一、一、基因工程技术的诞生及意义基因工程技术的诞生及意义 二、二、基因工程技术的基本原理基因工程技术的基本原理 38目目 录录高等教育出版社高等教育出版社基因克隆的基本原理及过程基因克隆的基本原理及过程 载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩增39目目 录录高等教育出版社高等教育出版社第二节第二节 基因工程的物质基础基因工程的物质基础n一、工具酶一、工具酶 （一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶 （二）（二）DNADNA聚合酶聚合酶 ( (三三) DNA) DNA连接酶连接酶 ( (四四

22、) ) 其它其它DNADNA修饰酶修饰酶40目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶 限制酶主要是从原核生物中分离纯化出限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制性核酸内切酶分为三类，在基因来的。限制性核酸内切酶分为三类，在基因工程操作中所说的限制酶，通常指工程操作中所说的限制酶，通常指类限制类限制性核酸内切酶。性核酸内切酶。 41目目 录录高等教育出版社高等教育出版社定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切

23、割双链围切割双链DNA的一类内切酶的一类内切酶,简称简称限制酶限制酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H42目目 录录高等教育出版社高等教育出版社作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）43目目 录录高等教育出版社高等教育出版社第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代

24、表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶44目目 录录高等教育出版社高等教育出版社类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口45目目 录录高等教育出版社高等教育出版社Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口46目目 录录高等教育出版社高等教育

25、出版社同功异源酶同功异源酶来源不同，但能识别和切割同一位点来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为的限制酶，称为同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst47目目 录录高等教育出版社高等教育出版社同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端称为这两个相同的粘性末端称为配配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTA

26、GG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A48目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n 限制酶的性质和作用特点限制酶的性质和作用特点 限制酶识别序列的长度一般为限制酶识别序列的长度一般为4-6个核苷酸。个核苷酸。 切割切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生分子中的磷酸二酯键，产生5 -P、3 -OH的的DNA片段。片段。 限制酶切割限制酶切割DNA分子形成黏性末端分子形成黏性末端(sticky end)和平末端或钝末端和平末端或钝末端(blunt end)两种两种 。 49目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n5 CTGCA G3 Pst识别序列识别

27、序列 3 G ACGTC5 形成形成3 -OH黏性末端黏性末端 n5 G AATTC3 EcoR识别序列识别序列 3 CTTAA G5 形成形成5 -P黏性末端黏性末端 n5 AG CT 3 Alu 识别序列识别序列 3 TC GA 5 切割后形成平末端切割后形成平末端 50目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n限制性核酸内切酶的用途限制性核酸内切酶的用途: 改造和构建新质粒；改造和构建新质粒； 建立建立DNA物理图谱；物理图谱； 基因组基因组DNA同源性研究；同源性研究； 基因克隆；基因克隆； DNA分子杂交及序列分析；分子杂交及序列分析； 制备制备DNA放射性探针；放射性探针； DNA甲

28、基化碱基的识别与切割等甲基化碱基的识别与切割等。 51目目 录录高等教育出版社高等教育出版社（二）（二） DNA连接酶连接酶 nDNA连接酶（连接酶（DNA ligase）是基因工程）是基因工程中所必需的一类酶。它能催化中所必需的一类酶。它能催化DNA中相中相邻的邻的5 -磷酸基和磷酸基和3 -羟基末端之间形成磷羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酸二酯键，使DNA单链缺口连接起来，单链缺口连接起来，形成完整形成完整DNA分子。分子。在基因工程中，在基因工程中，最常用的最常用的DNA连接酶为连接酶为T4DNA连接连接酶。酶。 52目目 录录高等教育出版社高等教育出版社3 3 5 5 失去磷酸二酯键的

29、缺口失去磷酸二酯键的缺口连接酶封闭缺口连接酶封闭缺口DNADNA连接酶连接双链中的单链缺口连接酶连接双链中的单链缺口53目目 录录高等教育出版社高等教育出版社表表8-1 重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶n 酶的名称酶的名称 功功 能能n限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNAnDNA聚合酶聚合酶 合成双链合成双链cDNA的第二条链的第二条链n 缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针n 填补填补3 末端末端n逆转录酶逆转录酶 合成合成cDNAn 替代替代DNA聚合酶聚合酶进行填补，标记或进行填补，标记或 DNA序列分析序列分析nDNA连

30、接酶连接酶 催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端羟基末端 之间形成的磷酸二酯键，使之间形成的磷酸二酯键，使DNA切口封合或切口封合或 使两个使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接n多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针n末端转移酶末端转移酶 在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾n碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基54目目 录录高等教育出版社高等教育出版社二二 基因载体基因载体定义定义载体（载体（vector）为携带目的基因，实为携带目的基因，实现其无性

31、繁殖或表达有意义的蛋白质所采现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些用的一些DNA分子。它分子。它是能携带外源是能携带外源DNA分子进入受体细胞并进行扩增和表达的运分子进入受体细胞并进行扩增和表达的运载工具。载工具。常用载体常用载体 质粒质粒DNA, 噬菌体噬菌体DNA, 病毒病毒DNA.55目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n（一）克隆载体（一）克隆载体 1. 质粒载体质粒载体 2. 噬菌体载体噬菌体载体 3. 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 （二）表达载体（二）表达载体 1. 大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体 2. 真核表达载体真核表达载体基因载体种类基因载体种类56目目 录

32、录高等教育出版社高等教育出版社克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。57目目 录录高等教育出版社高等教育出版社基因载体应具备的条件：基因载体应具备的条件：具有自主复制能力；具有自主复制能力；有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点（位点（MCS）具有一个

33、或多个选择性遗传标记具有一个或多个选择性遗传标记 分子量小，能容纳较大的外源分子量小，能容纳较大的外源DNA分子分子具有较高拷贝数，便于分离提纯；具有较高拷贝数，便于分离提纯； 具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。 58目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 （一）克隆载体（一）克隆载体1. 质粒质粒 质粒（质粒（plasmid）是存在于细菌染色）是存在于细菌染色体之外的、具有自主复制能力的双链环体之外的、具有自主复制能力的双链环状状DNA分子。分子。 常用的质粒载体有常用的质粒载体有pBR322(图图8-3)、pUC系列及系列及TA克隆载克隆载体等多种。体等多种。 59目目 录录高等

34、教育出版社高等教育出版社特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 60目目 录录高等教育出版社高等教育出版社61目目 录录高等教育出版社高等教育出版社62目目 录录高等教育出版社高等教育出版社63目目 录录高等教育出版社高等教育出版社npUC系列载体的优点：系列载体的优点：具有较小的分子量和较高的拷贝数。具有较小的分子量和较高的拷贝数。适用于组织化学方法检测重组体。适用于组织化学方法检测重组体。pUCpUC载体系列的载体系列的MCSMCS与与M13mpM13mp系列对应，因

35、系列对应，因此克隆的外源此克隆的外源DNADNA片段就可以在两类载体片段就可以在两类载体系列之间来回系列之间来回“穿梭穿梭”，使得克隆序列的，使得克隆序列的测序极为方便。测序极为方便。 64目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 nTA克隆载体克隆载体是专为克隆是专为克隆PCR产物而设计的一种产物而设计的一种特殊质粒载体，它们的共同点是在其多克隆位点特殊质粒载体，它们的共同点是在其多克隆位点两侧的两侧的3 末端携带有未配对的末端携带有未配对的T碱基，多克隆位碱基，多克隆位点均位于点均位于 半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 肽编码区内和都含有肽编码区内和都含有T7启动子。由于大部分耐热的启动子。由于大部

36、分耐热的DNA聚合酶（如聚合酶（如Taq、Tth等）扩增时都会有在等）扩增时都会有在PCR产物产物3 末端加末端加上一个上一个A碱基的特性，可与载体碱基的特性，可与载体3 末端的末端的T互补互补连接，同时连接，同时3 端端T突出端可以防此载体的自身环突出端可以防此载体的自身环化，可大大提高化，可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。常产物的连接和克隆效率。常见见TA载体有载体有pBS-T、pGM-T、pCF-T、pGW-T等。等。65目目 录录高等教育出版社高等教育出版社66目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 67目目 录录高等教育出版社高等教育出版社2. 噬菌体噬菌体(bacterioph

37、age，phage)nM13噬菌体是一类细菌病毒，其为单链环噬菌体是一类细菌病毒，其为单链环状状DNADNA分子分子, ,可用于克隆和扩增特定的可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用克隆载体。片段，是广泛使用克隆载体。nM13噬菌体优点：噬菌体优点：一是允许包装大于病毒一是允许包装大于病毒单位长度的外源单位长度的外源DNADNA；二是它感染细菌后，；二是它感染细菌后，其复制型是双链，分泌出来的则是单链其复制型是双链，分泌出来的则是单链。因此，因此，M13噬菌体可用于噬菌体可用于DNA序列分析，序列分析，制备单链制备单链DNA(DNA(探针探针) )及进行定点突变研究及进行定点突变研究等。

38、等。 68目目 录录高等教育出版社高等教育出版社69目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 n为了便于为了便于克隆外源克隆外源DNADNA片段片段, ,在野生型噬菌体基在野生型噬菌体基因因和基因和基因之间插入之间插入lacylacy启动子启动子- -操纵元件操纵元件序列扩编码序列扩编码- -半乳糖苷酶前半乳糖苷酶前145145个氨基酸的核个氨基酸的核苷酸序列苷酸序列, ,并有多克隆位点并有多克隆位点, ,依据这些位点序列依据这些位点序列不同不同, ,构成构成M13mp系列系列,如如M13mp2, M13mp 10,M13mp18, M13mp19等等.n当细菌内复制当细菌内复制型型M13的拷贝

39、数累积到的拷贝数累积到100-200后后, DNADNA的合成就变成不对称的合成就变成不对称,只有一条链进行复制只有一条链进行复制,从而产生大量的从而产生大量的DNA单链单链,并包装到成熟的并包装到成熟的噬噬菌体菌体颗粒中颗粒中,然后排出细菌体外然后排出细菌体外.70目目 录录高等教育出版社高等教育出版社噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统: gt系列（插入型系列（插入型): 能能克隆克隆7kb以下的外以下的外源源DNA片段片段, 适用适用cDNA克隆克隆.EMBL系列（置换型系列（置换型): 替代片段大小为替代片段大小为9-23kb, 适用基因组克隆适用基因组克隆. 71目目 录录高等教育出版

40、社高等教育出版社粘性质粒粘性质粒(cosmid)n粘性质粒又称粘粒粘性质粒又称粘粒,由由噬菌体噬菌体DNA的的cos区与区与质粒重新构建的载体质粒重新构建的载体,为双链环状为双链环状DNA,具有与具有与质粒相同的结构质粒相同的结构,但克隆容量比质粒大但克隆容量比质粒大,其容量其容量可达可达40-50kb. 粘性质粒的特点为粘性质粒的特点为: 1.具有质粒的抗药性标记具有质粒的抗药性标记, 如如Ampr或或Tetr基因基因及其复制成分及其复制成分; 2.具有具有噬菌体的噬菌体的cos区区,这是体外包装必须的这是体外包装必须的成分成分; 3.具有一个以上限制酶酶切位点具有一个以上限制酶酶切位点;

41、4.因非重组的粘粒很小因非重组的粘粒很小,不能进行体外包装不能进行体外包装,有有利于重组体的筛选利于重组体的筛选.72目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n3. 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 (YAC) YAC是第一个成功构建的人工染色是第一个成功构建的人工染色体载体，也是目前能容纳最大量体载体，也是目前能容纳最大量(100万万bp)外源外源DNA片段的载体片段的载体.典型的典型的YAC载体结构及基因克隆过程如下图载体结构及基因克隆过程如下图所示。所示。 73目目 录录高等教育出版社高等教育出版社74目目 录录高等教育出版社高等教育出版社（二）表达载体（二）表达载体（expressi

42、ng vector） 表达载体是用来在受体细胞中表达外源基表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性质外，还需要有能表达外源基因所必需的质外，还需要有能表达外源基因所必需的DNA序列序列（如启动子、核糖体结合位点和转（如启动子、核糖体结合位点和转录终止调控序列等）。录终止调控序列等）。 按宿主细胞的不同，可将表达载体又分为按宿主细胞的不同，可将表达载体又分为原核细胞表达载体、酵母细胞表达载体、哺原核细胞表达载体、酵母细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体和昆虫细胞表达载体。乳动物细胞表达载体和昆虫细胞表达载体。 75目目 录录高

43、等教育出版社高等教育出版社npRSET载体载体 它是一个两用载体，它是一个两用载体，它既可作为表达它既可作为表达融合型蛋白的载体，也可作为表达非融融合型蛋白的载体，也可作为表达非融合型蛋白的载体。该载体含有合型蛋白的载体。该载体含有Amp抗性抗性基因和一个强的基因和一个强的T7噬菌体启动子，在启噬菌体启动子，在启动子与终止信号之间有动子与终止信号之间有RBS和和多克隆位多克隆位点。点。 76目目 录录高等教育出版社高等教育出版社77目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 78目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 n真核表达载体真核表达载体都含有一套真核表达元件，即启都含有一套真核表达元件，即

44、启动子动子/增强子、克隆位点、终止信号和加工增强子、克隆位点、终止信号和加工poly(A)的信号。如的信号。如pcDNA3.1载体（见图载体（见图8-13）是常用的真核表达载体之一。该载体含有）是常用的真核表达载体之一。该载体含有一个高效表达的一个高效表达的CMV启动子、多克隆位点、原启动子、多克隆位点、原核细胞复制起始点、用于原核细胞筛选的核细胞复制起始点、用于原核细胞筛选的Amp抗性基因和真核细胞筛选的抗性基因抗性基因和真核细胞筛选的抗性基因(Neor)及小牛生长激素的及小牛生长激素的poly(A)。 79目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 80目目 录录高等教育出版社高等教育出版社

45、n腺相关病毒（腺相关病毒（AdenoAdeno-associated virus, AAV-associated virus, AAV）是一种细小病毒科依赖病毒属的单链是一种细小病毒科依赖病毒属的单链DNADNA病毒。病毒。基因组全长基因组全长4.6 kb4.6 kb，共含，共含2 2个结构基因，分别编个结构基因，分别编码病毒复制和组装必需的蛋白质。基因组两端的码病毒复制和组装必需的蛋白质。基因组两端的反向末端重复序列（反向末端重复序列（ITRITR）是腺相关病毒复制、）是腺相关病毒复制、整合及包装所必需的顺式作用元件。整合及包装所必需的顺式作用元件。AAVAAV载体可载体可用于体内或体外感染

46、肌肉、神经、肝及造血细胞，用于体内或体外感染肌肉、神经、肝及造血细胞，目前目前多用于多用于 - -地中海贫血等单基因遗传病基因治地中海贫血等单基因遗传病基因治疗的载体。疗的载体。 81目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 nAAVAAV载体的优点：载体的优点：可感染多种细胞，包括非分可感染多种细胞，包括非分裂期细胞；免疫原性小、毒性低和致病性弱；裂期细胞；免疫原性小、毒性低和致病性弱；能特异地整合到人的能特异地整合到人的1919号染色体中号染色体中; ;它介导它介导整合到人染色体中的外源基因能在人染色体中长整合到人染色体中的外源基因能在人染色体中长期稳定表达。期稳定表达。n其不足之处其不足之

47、处: :成熟病毒颗粒的形成需腺病毒或疱成熟病毒颗粒的形成需腺病毒或疱疹病毒协助和容纳外源基因的容量较小（约疹病毒协助和容纳外源基因的容量较小（约4kb4kb）。）。n用外源基因及其调控序列置换用外源基因及其调控序列置换AVVAVV的结构基因，的结构基因，保留其两端的保留其两端的ITRITR结构，可构建腺相关病毒重组结构，可构建腺相关病毒重组载体，用于基因治疗。但重组载体，用于基因治疗。但重组AVVAVV大多失去了野大多失去了野生型病毒整合人靶细胞基因组的特异性。生型病毒整合人靶细胞基因组的特异性。82目目 录录高等教育出版社高等教育出版社第三节第三节 基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程n基因

48、克隆的基本过程主要应包括：基因克隆的基本过程主要应包括：目的基因的获取；目的基因的获取；基因载体的选择与构建；基因载体的选择与构建；基因载体与目的基因的连接基因载体与目的基因的连接（构建（构建DNA重重组体）；组体）；DNA重组体导入受体细胞；重组体导入受体细胞；含含DNA重组体细胞（转化子重组体细胞（转化子）或菌落的筛）或菌落的筛选与鉴定。选与鉴定。 83目目 录录高等教育出版社高等教育出版社基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程 载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩增84目目 录录高等教育出版社高等教育出版社 85目目 录录高等教育出版社高等教育出版社一、目的基因的获取一、目的基因的获取n(

49、一一) 直接从基因组直接从基因组DNA中分离中分离 n(二二) 化学合成法化学合成法 n(三三) 逆转录法逆转录法 n(四四) 聚合酶链反应聚合酶链反应 n(五五) 从基因文库中筛选获得从基因文库中筛选获得 86目目 录录高等教育出版社高等教育出版社1. 1. 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列87目目 录录高等教育出版社高等教育出版社组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库

50、文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2. 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目目 录录88目目 录录高等教育出版社高等教育出版社限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb

51、 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库目目 录录89目目 录录高等教育出版社高等教育出版社mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 3. 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录90目目 录录高等教育出版社高等教育出版社4.聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法）方法 nPCR实际上是一种利用酶反应在体外获得基

52、因实际上是一种利用酶反应在体外获得基因组中特异的组中特异的DNA序列或序列或cDNA序列方法，多采序列方法，多采用用RT-PCR.n该方法的特点是简便、快捷、特异性强、灵敏该方法的特点是简便、快捷、特异性强、灵敏度高，是目前分子生物学中应用最广的新技术。度高，是目前分子生物学中应用最广的新技术。n另外另外,近来近来mRNA差异显示技术和差异蛋白质差异显示技术和差异蛋白质谱表达技术谱表达技术也被用来筛选差异表达基因和功能也被用来筛选差异表达基因和功能基因。基因。 91目目 录录高等教育出版社高等教育出版社5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5

53、Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录92目目 录录高等教育出版社高等教育出版社Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录93目目 录录高等教育出版社高等教育出版社n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分94目目 录录高等教育出版社高等教育出版社PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延

54、伸延伸72C退火退火Tm-5C95目目 录录高等教育出版社高等教育出版社（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途96目目 录录高等教育出版社高等教育出版社几种重要的几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术97目目 录录高等教育出版社高等教育出版社实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录98目目 录录高等

55、教育出版社高等教育出版社二、基因载体的选择与制备二、基因载体的选择与制备n基因克隆中基因载体的选择与构建基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作，它直接是一项技术性很强的工作，它直接影响到基因克隆的成败。一般应从影响到基因克隆的成败。一般应从目的基因、所用限制酶及受体菌目的基因、所用限制酶及受体菌（细胞）的特性综合考虑。（细胞）的特性综合考虑。 99目目 录录高等教育出版社高等教育出版社三、三、DNA重组体的构建重组体的构建（一）目的基因与基因载体的连接（一）目的基因与基因载体的连接1. 粘端连接法粘端连接法2. 平端连接法平端连接法3. 人工接头连接法人工接头连接法4. 同聚物加

56、尾连接法同聚物加尾连接法100目目 录录高等教育出版社高等教育出版社1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接101目目 录录高等教育出版社高等教育出版社Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGC

57、CTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自连目的基因自连载体自连载体自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录102目目 录录高等教育出版社高等教育出版社不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCG

58、ATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目目 录录103目目 录录高等教育出版社高等教育出版社2. 平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端104目目 录录高等教育出版社高等教育出版社目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重

59、组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录105目目 录录高等教育出版社高等教育出版社3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。106目目 录录高等教育出版社高等教育出版社5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA

60、A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录107目目 录录高等教育出版社高等教育出版社4. 人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。 108目目 录录高等教育出版社高等教育出版社人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco R