PCR引物设计2

1、汕大医汕大医2009级级闫银侠闫银CR 引物设计引物设计nPCR 的基本原理nPCR引物设计的基本原则n常用PCR引物设计软件nPrimer Premier 5.0 介绍n PCR PCR 的基本原理的基本原理 引物引物n引物的概念 引物是一段寡聚核苷酸序列，它是PCR特异反应的关键。n引物的种类 PCR引物 测序引物 杂交探针 简并引物 其他引物n引物的作用 基因获得，测序以及检测等。引物设计的原则引物设计的原则三条最基本的原则：n引物与模板的序列要紧密互补n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。主要

2、影响因素主要影响因素n引物长度n产物长度n序列Tm 值n引物与模板形成双链的内部稳定性n形成引物二聚体及发夹结构的能值n在错配位点的引发效率n引物及产物的GC 含量引物设计的要点引物设计的要点n引物最好在模板cDNA的保守区内设计。n引物长度一般在15-30bp之间，常用的是18-27bp，不应超过38bp。 引物过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。n引物G+C的含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72。 上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)； 有效启动温度，即

3、退火温度，一般低于Tm值5-10；n引物3端要避开密码子的第3位。 密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性和效率。n引物3端不能选择A。 3错配时，不同碱基引发效率存在差异：AG,CT,所以避开A而 选择T。nA T C G在引物中要随机分布。 可以降低引物与模板的相似性，从而减少错误引发。n引物自身以及引物之间不应存在互补序列。 防止形成发夹结构和引物二聚体n引物5端和中间G值应该相对较高，3端G值应该相对较低。 G值越高，双链越稳定，但容易在3错配位置形成双链结构引发DNA聚合。n引物的5端可以修饰，3端不可以修饰。 引物5决定PCR产物的长度，对特异性影响不大。n扩增产物的单链不能

4、形成二级结构 二级结构是造成引物无效的主要原因，设计引物时一定要避开二级结构域。n引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行Blast检测，如果与其他基因不具有互补性，就可以进行下一步实验了。 当然，各种模板的引物设计难度不一，有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或者偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物，用作克隆目的的PCR，由于片段相对固定，其引物设计的自由度较低，所以这时候，只要尽量满足这些条件就可以了。酶切位点的添加酶切位点的添加n引物设计时计算Tm值，退火温度以及GC含量时，不用把酶切位点和保护碱基计算在内。n两个位点应是载体上的，所连接的片段上没有这两个位点，且距离不能

5、太近，否则两个酶都切不好。n两个酶切位点最好不是同尾酶，否则酶切效果相当于单酶切。n最好使用酶切效率高的酶，双酶切使用的酶最好有共同的Buffer。n酶切位点需要保护性碱基，以利于内切酶的切割。n设计时酶切位点应位于引物5顶端。PCRPCR设计引物时酶切位点的保护碱基设计引物时酶切位点的保护碱基表（例）表（例） 应用简介应用简介Primer Primer 5.0n引物设计功能 n限制性酶切位点分析功能n n蛋白模体基元和活性位点分析功能 n同源性分析和DNA与蛋白质序列的互换 使用步骤及技巧使用步骤及技巧Load sequencePreimer Premier 启动界面进行引物设计时，点击 按

6、钮，界面如下：进一步点击 按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围 产物大小范围引物长度选择方式参数选择参数选择，一般选择默认，点击 ，随之出现的Search Progress窗口显示Search Complete时，再按 。默认成对（pairs）显示，共找到100对引物，并按照优劣次序（Rating）排列，满分100分，即各项指标基本都达标。点击其中一对引物，例如第1对，并挪开或退出该窗口，显示“primer primer 5”主窗口，如下：产物以及模板位置引物性质四种重要指标的分析最佳退火温度可供参考一对理想的引物应

7、当不存在四种指标中的任何一种，因此最好的情况是最下面的分析栏里没有 ，只有 。但是，通常情况下，会出现这种情况：此时，就需要对引物进行编辑，点击Edit hereAnalysis the result after editingAccept the edit result Return to the main windowResults Report限制性内切酶分析Melting temperature graphGC% graphStability/tools/primer-blast/在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。如果你已经设