目的基因的克隆与基因组文库的建立

1、第三章目的基因的克隆与基因组文库的建立第1页，共73页。第一节、基因克隆基因克隆？第2页，共73页。基因克隆；经无性繁殖获得基因许多相同基因拷贝的过程第3页，共73页。第4页，共73页。抽取抽取DNA切下鼠切下鼠DNA切开质粒切开质粒DNA将质粒导入宿主细胞将质粒导入宿主细胞混合、连接混合、连接 第5页，共73页。培养基中加抗生素培养基中加抗生素培养培养裂解细胞释放裂解细胞释放DNA分子分子杂交杂交分离扩增目的克隆分离扩增目的克隆第6页，共73页。第7页，共73页。第8页，共73页。基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤 1、目的基因的取得目的基因的取得 2、 载体的选择载体的选择 3、

2、目的基因与载体、目的基因与载体DNA的体外重组的体外重组 4、重组载体引入受体细胞、重组载体引入受体细胞 5、表达筛选、表达筛选第9页，共73页。第10页，共73页。基因克隆与基因表达产物有何不同？第11页，共73页。第12页，共73页。（一）DNA片段的获得 1、从基因所在的生物体直接取得限制性内切酶（restriction enzymes） 2、人工合成DNA片段（DNA合成仪） 3、PCR反应合成DNA 4、 mRNA反转录成cDNA5、用机械的方法超声波、第13页，共73页。 M 1 2 3 Kb. 23.1 9.46.5 4.3 2.32.0 图3 不同酶切时间电泳图 M Hindm

3、arkers 1 酶切10分钟 2 酶切20分钟 3 酶切5分钟 回收回收2-7Kb DNA 2-7Kb DNA 第14页，共73页。(二）、载体的选择二）、载体的选择 第15页，共73页。载体的种类：载体的种类：1 1、质粒载体、质粒载体2 2、入噬菌体载体、入噬菌体载体3 3、柯斯质粒载体、柯斯质粒载体4 4、M13M13噬菌体载体噬菌体载体5 5、真核细胞的克隆载体：、真核细胞的克隆载体：酶母质粒载体、病毒载体酶母质粒载体、病毒载体6 6、人工染色体、人工染色体第16页，共73页。切第17页，共73页。（三）、目的基因与载体（三）、目的基因与载体DNA的体外重组的体外重组用用DNA连接酶

4、将含有外源基因的连接酶将含有外源基因的DNA片断接片断接到载体上，形成到载体上，形成DNA重组分子；重组分子；第18页，共73页。第19页，共73页。（四）、重组载体引入受体细胞（四）、重组载体引入受体细胞 重组载体引入受体细胞，使基因扩重组载体引入受体细胞，使基因扩增和表达出供体基因所提供的部分遗传增和表达出供体基因所提供的部分遗传性状性状。第20页，共73页。转第21页，共73页。第22页，共73页。第23页，共73页。50-100mmol/LCaCl2 第24页，共73页。第25页，共73页。筛第26页，共73页。第27页，共73页。pBR322AmpTet第28页，共73页。AmN2H

5、第29页，共73页。第30页，共73页。第31页，共73页。第32页，共73页。第33页，共73页。滤膜（固定抗体）+第34页，共73页。ACTGAAGGCT第35页，共73页。 第二节第二节 基因文库的建立基因文库的建立 真核生物基因组真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是十分庞大，其复杂程度是蛋白质和蛋白质和mRNA的的100倍左右倍左右，而且含有大量的重复序列。，而且含有大量的重复序列。 采用采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。 在生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体

6、的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库 。第36页，共73页。基因文库基因文库(gene library) 指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。按照外源 DNA 片段的来源，可将基因文库分为： 基因组文库基因组文库(genomic library) （含有全部基因） cDNA文库文库(complementary DNA library) （含有全部蛋白质编码的结构基因）

7、 第37页，共73页。基因文库的完备性代表性和随机性代表性和随机性代表性是指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。在文库的构建过程中引用了两个策略，一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性，保证每段 DNA 在文库中出现的频率均等；二是提高文库所含基因组 DNA 的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。第38页，共73页。为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目， Clark 和 Carbon 于 1975 年提出如下的计算公式： N = ln ( 1

8、 P ) / ln ( 1 f )N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 第39页，共73页。例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 9 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆第40页，共73页。基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大 以减

9、轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选第41页，共73页。一、基因组 DNA 文库1.基因组 DNA 文库：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。2、目、目 的：的： a）分离有用的目的基因）分离有用的目的基因 b）保存某种生物的全部基因）保存某种生物的全部基因第42页，共73页。3、相对于、相对于cDNAcDNA文库，基因组文库的优点：

10、文库，基因组文库的优点：cDNAcDNA克隆只能反映着克隆只能反映着mRNAmRNA的分子结构，没有包括基因组的分子结构，没有包括基因组的间隔序列。的间隔序列。 cDNAcDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNAmRNA的分的分布状态，即：高丰度布状态，即：高丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，所占比例较高克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度，分离基因容易；低丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，所占比例较克隆，所占比例较低，分离基因困难；低，分离基因困难； 从从cDNAcDNA克隆中，不能克隆到基因组克隆中，不能克隆到基因组

11、DNA DNA 中的非转录中的非转录区段的序列，不能用于研究基因编码区外侧的调控区段的序列，不能用于研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能。序列的结构与功能。第43页，共73页。 基因组文库 cDNA文库信息供体 DNA mRNA载体 噬菌体，黏粒，人工染色体 质粒，噬菌体连接前 部分酶切，分级分离 反转录合成cDNA双链 连接 粘端连接，人工接头 同聚物加尾，人工接头筛选 核酸探针 核酸探针，免疫探针基因组文库和cDNA文库的比较第44页，共73页。4.基因文库的构建流程组织可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分酶解DNADNA长度分级双链cDNADNA与载体连接 引入宿主细胞鉴定文

12、库的完备性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆第45页，共73页。基因组文库的构建流程 载体的选择和制备； 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取； 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离； 载体与DNA片段的连接； 转化或侵染宿主细胞。 第46页，共73页。基因组DNA文库限制性内切酶限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装第47页，共73页。载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或

13、l-DNA上述几种载体的最大装载量如下：第48页，共73页。质粒 15kbl-DNA 25kbCosmid 45kbBAC 300kbYAC 400kb 载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌第49页，共73页。基因组DNA的制备 为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性， DNA在分离纯化操作中应避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，文库的重组率和完备性也就越高。 一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的 35 倍。 实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。第50页，共

14、73页。 用常规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 100 kb大小的DNA片段第51页，共73页。 基因组DNA的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切,其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用4 碱基识别序列的限制性内切酶，如：SauA或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控, 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的D

15、NA片段随机连为一体！第52页，共73页。 载体与载体与DNA片段的连接片段的连接 在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！ 方法一：粘末端连接 方法二：人工接头法第53页，共73页。文库的连接转化或包装侵染文库的连接转化或包装侵染在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。第54页，共73页。第55页，共73页。构建基因组文库应注意的问题1、构建一个文库，插入DNA和载体DNA的

16、质量是成功与否的关键。基因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。 2、不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。 第56页，共73页。3、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查

17、限制酶和DNA浓度及纯度。 第57页，共73页。4、在考虑把噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要参数：噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和纯度。大约10pg噬菌臂和4gDNA能产生有效地包装。对一个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于11066l06。 第58页，共73页。5、包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在-70中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬

18、菌斑。第59页，共73页。二、cDNA文库的构建流程 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； 第一链 cDNA 合成； 第二链 cDNA 合成； 双链 cDNA 克隆到载体并导入宿主细胞中繁殖。 第60页，共73页。第61页，共73页。cDNA文库的标准流程 Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定pBlueScript cDNA库扩增第62页，共73页。（一）、 RNA 的分离mRNA 的完整性 mRNA 的丰度 （丰度高用质粒，丰度低用噬菌体）mRNA 的富集 第63页，共73页。（二）、cDNA 第一链的

19、合成 反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和随机引物 Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是指 Oligo（dT）引物与 mRNA 3 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于 cDNA 末端存在较长的 poly（A）而影响 cDNA 测序。 第64页，共73页。 随机引物引导的 cDNA 合成是采用 610 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的起点。 由于随机引物

20、可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。第65页，共73页。（三）、cDNA 第二链的合成 自身引导法置换合成法引导合成法第66页，共73页。煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1第67页，共73页。DNApol dNTPsRNaseH置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 55 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55A