聚合酶链反应技术(PCR)

1、聚合酶链反应技术(PCR) PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某在一个试管内将所要研究的目的基因或某一一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用几星期才能做到的事情，用PCR几小时便几小时便

2、可完成。可完成。PCR技术是生物医学领域中的一技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。项革命性创举和里程碑。 Mullis 1993 年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。 PCR技术是一种利用技术是一种利用DNA变性和复性原变性和复性原理在体外进行特定的理在体外进行特定的DNA片段高效扩增片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列（的技术，可检出微量靶序列（1个个copy）。在模板）。在模板DNA、引物和、引物和dNTP存存在的条件下依赖于在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合聚合酶的酶促合成反应。成反应。 仅需用极少量模板，在一对引物介导下，仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增

3、至在数小时内可扩增至100-200万万copy. PCR(Polymerase Chain Reaction)Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.PCR反应分三步：变性、退火及延伸。反应分三步：变性、退火及延伸。 PCR技术的基本原理技术的基本原理其特异性依赖于与靶序列两端互补其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。的寡核苷酸引物。 模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时左右一定时间后，使模板间后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解解

4、离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；备； 模板模板DNA与引物的退火：模板与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温变性成单链后，温度降至度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合；单链的互补配对结合； 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互链互补链，而且这种新链又可成为

5、下次循环的模板。每完成一补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需个循环需24min，23h就能将待扩目的基因扩增放大就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。几百万倍。 标准的标准的PCR反应体系：反应体系：10Buffer 10uldNTP mixture per 200umol/Lprimers per 10100pmoltemplete DNA 2ug DNA polymerase Mg2+ 1.5mmol/LdH2O 100ul PCR反应五要素：参加反应五要素：参加PCR反应的物质反应的物质主要有五种即引物、酶、主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+ 引物

6、：引物是引物：引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度 遗传性疾病遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症肝炎性病肿瘤 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位分子标记辅助育种了解不

7、同品种间的亲缘关系、系统进化畜禽病诊断:猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒性腹泻、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达：转基因鱼杀虫病原微生物的基因型鉴定植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分其他考古学植物分类学群体生态学 定量定量PCR是在是在PCR定性技术基础上发展起定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技技术是一种在术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实

8、时监测整个利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点无污染性、具实时性和准确性等特点 。 实时荧光定量实时荧光定量PCR常用的检测模式：常用的检测模式： （1）TaqMan探针探针 （2）SYBR Green 原理：利用原理：利用Taq 酶的酶的53外切核酸酶活性外切核酸酶

9、活性并在并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记过程中反应体系加入一个荧光标记探针。探针。 TaqMan探针探针5端标以荧光发射基团，端标以荧光发射基团，3端标以荧光猝灭基团。该探针在端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中过程中不能被延伸。当探针保持完整时，不能被延伸。当探针保持完整时，3端猝灭端猝灭基团抑制基团抑制5发射基团的荧光发射。发射基团的荧光发射。 在在PCR的退火期，探针与引物所包含序列的退火期，探针与引物所包含序列内的内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引模板发生特异性杂交。延伸期引物在物在Taq酶作用下沿酶作用下沿DNA模板延伸，当到达模板延伸，当到达探针处，探针处，Taq酶

10、发挥酶发挥53外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，继而发生置换，切断探针后，发射基团远继而发生置换，切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。离猝灭基团，荧光信号得到释放。 这时荧光探测系统便会检测到光密度增这时荧光探测系统便会检测到光密度增加。模板每复制一次，就有一个探针被切加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴有一个荧光信号的释放。断，伴有一个荧光信号的释放。 由于被释放的荧光基团数目和由于被释放的荧光基团数目和PCR产物产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板准

11、确定量。由于扩增产物短时术可对模板准确定量。由于扩增产物短时效率较高，故扩增长度一般为效率较高，故扩增长度一般为50150bp。 实时实时PCRPCR技术原理技术原理 (1) GC (1) GC碱基含量在碱基含量在40%-60%40%-60%。（2 2） 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G G。（3 3）避免）避免55端为端为G G， 因为因为G G对荧光可能有抑制作用，对荧光可能有抑制作用，尽量使尽量使C C个数多于个数多于G G。（4 4）长度应在）长度应在15-2515-25个碱基左右，以保证结合的个碱基左右，以保证结合的特异性。特异性。（5 5）探针的）探针的TmTm值要比引物的值要比引物的TmTm值至少高出约值至少高出约1010另外，探针与引物不能形成二聚体，另外，探针与引物不能形成二聚体， 位置与上游引位置与上游引物尽量接近但不要重叠。物尽量接近但不要重叠。 SYBR Green I是一种只与双链是一种只与双链DNA小沟结小沟结合的染料，当它与合的染料，当它与DNA双链结合时，发出双链结合时，发出荧光；从荧光；从DNA双链上释放出来时