细菌的革兰氏染色观察学习教案

1、会计学1细菌细菌(xjn)的革兰氏染色观察的革兰氏染色观察第一页，共18页。一、实验目的：一、实验目的： 1 1、学习微生物涂片、染色的操作技、学习微生物涂片、染色的操作技术术(jsh)(jsh)，掌握细菌单染色法、革兰，掌握细菌单染色法、革兰氏染色的方法；氏染色的方法； 2 2、学习并掌握油镜的原理和使用方、学习并掌握油镜的原理和使用方法。法。第2页/共18页第二页，共18页。二、原理：二、原理：（一）油镜：（一）油镜： 显微镜的分辨力是指显显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。小距离的能力。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表显微镜的分辨力是用可分

2、辨的最小距离来表示：示： 能辨别两点之间最小距离能辨别两点之间最小距离D=/D=/（2NA2NA） 式中式中 = =光波波长光波波长 NA= NA=物镜的数物镜的数值孔径值孔径物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微镜的分辨力越大，被检物体的细微结构也愈镜的分辨力越大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出。能明晰地区别出。我们肉眼所能感受的光波平均我们肉眼所能感受的光波平均(pngjn)(pngjn)长度为长度为0.55m0.55m。 使 用使 用 N AN A 为为 0 . 6 50 . 6 5 高 倍 物 镜 ，高 倍 物 镜 ，D=0.55/(2x0.

3、65)=0.42mD=0.55/(2x0.65)=0.42m 使 用使 用 N AN A 为为 1 . 2 51 . 2 5 的 油 镜 ，的 油 镜 ，D=0.55/(2D=0.55/(21.25)=0.22m 1.25)=0.22m 第3页/共18页第三页，共18页。 高放大倍数高分辨力： 40 x高倍镜（NA=0.65）和24x目镜，总放大倍数为960，D=0.42m； 100 x的油镜（NA=1.25）和9x目镜，总的放大率为900，D=0.22m。 Olympus油镜刻有黑、白双圈，并标有“Oil”字样。 使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是一层油质，称

4、为油浸系。这种有常选用香柏油(折射率n=1.25，与玻璃相同)，当光线通过玻片后，可直接通过香柏油进入物镜发生折射；如果玻片与物镜之间的介质为空气，称为干燥系，光线在空气介质中因散射而减弱，这样就减低了视野(shy)的照明度。 第4页/共18页第四页，共18页。数值孔径数值孔径:即光线投射到物镜上的最大角度（镜口角）即光线投射到物镜上的最大角度（镜口角）的一半正弦，和玻片与物镜间介质的折射率的乘积。的一半正弦，和玻片与物镜间介质的折射率的乘积。 NA =n sin 式中式中n=介质折射率、介质折射率、=最大入射角的半数，最大入射角的半数，即镜口角的一半数即镜口角的一半数 光线投射到物镜的角度越

5、大，显微镜的效能越大，光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理的理论限度论限度(xind)为为900，如当光线入射角为，如当光线入射角为1200，其，其半数的正弦为半数的正弦为sin600=0.87。 以空气为介质时以空气为介质时 NA=10.87=0.87； 以水为介质时以水为介质时 NA=1.330.87=1.15; 以香柏油为介质时以香柏油为介质时 NA=1.520.87=1.32。 第5页/共18页第五页，共18页。 （二）单染色（二）单染色 由于细菌微小，无色透明，未经染色往往不易被识由于细菌

6、微小，无色透明，未经染色往往不易被识别，因此只有借助于染色法可使细菌着色，与背景形别，因此只有借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明对比，便容易在显微镜下观察。成鲜明对比，便容易在显微镜下观察。 细菌单染色的原理一般认为是微生物与各种不同性细菌单染色的原理一般认为是微生物与各种不同性质的染料具有亲和力而被着色。由于细菌的等电点较质的染料具有亲和力而被着色。由于细菌的等电点较低（低（pH2-5），故在近于中性），故在近于中性(zhngxng)的环境中，的环境中，细菌多带负电荷，易与碱性染料（带正电）结合而着细菌多带负电荷，易与碱性染料（带正电）结合而着色，因此细菌染色我们一般都用碱性苯胺染料如

7、美蓝色，因此细菌染色我们一般都用碱性苯胺染料如美蓝、碱性复红、结晶紫、沙黄、孔雀绿等。、碱性复红、结晶紫、沙黄、孔雀绿等。 单染色是一种染料使所有细胞都染上相同的颜色，单染色是一种染料使所有细胞都染上相同的颜色，此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。 第6页/共18页第六页，共18页。 （三）革兰氏染色（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于革兰氏染色法于1884年由丹麦医生年由丹麦医生Gram创立，是延用至今的经典染色法。创立，是延用至今的经典染色法。 经革兰氏染

8、色后可以把全部细菌分为经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和和G-两大类。两大类。 染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。 G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小(suxio)，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色；，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色； G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大或通透

9、性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红色。细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红色。 第7页/共18页第七页，共18页。细胞壁细胞壁革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 (G+)革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 (G-)厚度与强度厚度与强度厚、致密、坚韧薄、疏松肽聚糖数量、含量肽聚糖数量、含量多层、含量高、占细胞干重4090%单层、含量低、占细胞干重510%脂类含量脂类含量少、占细胞干重1-4%多、占细胞干重11-

10、22%磷壁酸（垣酸）磷壁酸（垣酸）+-脂多糖、磷脂、脂蛋白脂多糖、磷脂、脂蛋白-+肽聚糖肽聚糖脂蛋白脂蛋白磷壁酸磷壁酸外膜外膜第8页/共18页第八页，共18页。要超过24小时，以免影响染色性。第9页/共18页第九页，共18页。第10页/共18页第十页，共18页。第11页/共18页第十一页，共18页。滴生理盐水挑取菌苔一环涂片热固定干燥取菌液一环涂片干燥第12页/共18页第十二页，共18页。取菌涂片(t pin)的无菌操作图解第13页/共18页第十三页，共18页。细水冲洗(chngx)结晶(jijng)紫初染2min碘液媒染1min95%酒精(jijng)脱色 20s蕃红复染 12min细水冲洗

11、细水冲洗第14页/共18页第十四页，共18页。1. 先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到视野中央。2. 在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。3. 使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切记不能使用粗调，以免压碎载玻片。4. 用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方向。5. 观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦12次，把大部分油去掉(q dio)，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细心，动作要轻 。 第15页/共18页第十五页，共18页。G