工科分析化学分子发光分析法随堂讲义

1、第1515章 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法（Molecular Luminescence Analysis）分子吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由激发态分子吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由激发态返回基态时发射光谱返回基态时发射光谱 M+能量能量M M+热量热量 M+ h +热量热量光子光子 光致发光光致发光 M+ h M 阴极射线阴极射线 阴极射线发光阴极射线发光 荧光荧光 磷光磷光 X X 射线射线 X X 射线发光射线发光 F P 热热 白炽发光白炽发光 寿命寿命10-710-9s 10-310s超声波超声波 声纳发光声纳发光离子流离子流 离子发光离子发光化

2、学反应能化学反应能化学发光化学发光 M+化学能化学能M 第一次记录荧光现象第一次记录荧光现象 1575 1575 西班牙内科医生、植物西班牙内科医生、植物学家学家荧光是光发射概念、引入荧光术语荧光是光发射概念、引入荧光术语 1852 1852 Stokes Stokes 观察奎宁、叶绿素观察奎宁、叶绿素提出用荧光作为分折手段提出用荧光作为分折手段 1864 1864 StokesStokes第一个实际应用、铝一桑色素荧光测第一个实际应用、铝一桑色素荧光测 18671867 1965 1965以来以来, , 荧光光谱兴趣激增，生物化学荧光光谱兴趣激增，生物化学家利用它的高灵敏度。二十世纪七十年代

3、后家利用它的高灵敏度。二十世纪七十年代后期，引起国内学者注意期，引起国内学者注意第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法（Molecular Luminescence Analysis）第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法（Molecular Luminescence Analysis）15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素15-2 荧光分析法荧光分析法15-3 磷光分析法磷光分析法15-4 化学发光分析法化学发光分析法15-5 光化学传感器光化学传感器 荧光荧光 涉及吸收和发射两个过程涉及吸收和发射两个过程 1、激发态激发态 基态基态 激发态激发态 分

4、立轨道上分立轨道上 非成对电子非成对电子 平行自旋更平行自旋更 n n 稳定稳定 n n 净电子自旋净电子自旋 S=0 S=0 S=1 分子重态分子重态 M=2S+1=1 （跃迁几率很小）跃迁几率很小） M=2S+1=3 单重基态单重基态 S S0 0 激发单重态激发单重态 S S 激发三重态激发三重态 T T 电子从电子从 S S0 0 到到 S S 分子能量相应增加改变了分子对称性、分子能量相应增加改变了分子对称性、 分子净的电子自旋（多重性）可能改变分子净的电子自旋（多重性）可能改变第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因

5、素 2、去活化过程去活化过程溶液中：溶液中： 10-14-10-12 s 10-13-10-11 s 10-2-10-6 s 振动弛豫振动弛豫 内部转换内部转换 体系间的跨越体系间的跨越 （发生在相同多重度间）（发生在相同多重度间） （发生在不同多重度间）（发生在不同多重度间） S2 S1 T1(S1) T2 10-15 s A1 A2 F P 磷光发射磷光发射 10-2-10 s 基态基态 S0 荧光发射荧光发射 外部转换外部转换 10-7-10-9 s 发生在不同电子能态间发生在不同电子能态间 （熄灭）（熄灭）第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射

6、因素光致发光及影响荧光发射因素 2、去活化过程去活化过程注意点注意点 (1)气相分子中易观察到以发射光子方式失去振动能气相分子中易观察到以发射光子方式失去振动能(2) 实现内部转换实现内部转换 a. S1，S2 电子能级差小电子能级差小 、易实现。、易实现。 b. S1，S2 振动能级的位能面有交叉振动能级的位能面有交叉(3)体系间跨越的必要条件体系间跨越的必要条件 电子自旋与磁场微扰耦合电子自旋与磁场微扰耦合 a. S1、T1位能面在某处有容易达到的能量相交位能面在某处有容易达到的能量相交 激发态电子自旋反转，激发态电子自旋反转， b. 微观磁场的微观磁场的微扰微扰存在存在 分子多重态变化分

7、子多重态变化 产生产生 B Br r- -,I,I- -,CH,CH3 3I I重原子分子重原子分子 带电粒子的极性分子或可极化分子易产生磁效应带电粒子的极性分子或可极化分子易产生磁效应 或离子外层电子云疏松或离子外层电子云疏松 顺磁性分子顺磁性分子 O O2 2外层外层3 3d d5 5五个电子不成对五个电子不成对 内内 (4) 外部转换使发光熄灭现象外部转换使发光熄灭现象 重原子效应重原子效应 T1 S0 比比 S1 S0 可能性更大可能性更大 外（溶剂外（溶剂）(5) 去活化众多过程中，以速度最快、激发寿命最短的途径占优势去活化众多过程中，以速度最快、激发寿命最短的途径占优势，相互竞争。

8、，相互竞争。 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 、荧光的一些基本问题、荧光的一些基本问题 a. 荧光类型荧光类型 (1) 从寿命从寿命 瞬时荧光瞬时荧光 1010-8-8s s 内发射内发射 分析中有意义分析中有意义! S S1 1S S0 0+ + h S S1 1+ +S S0 0 ( (S S1 1 S S0 0) ) 22S S0 0+ + h 受激准分子受激准分子 迟滞荧光迟滞荧光 波长同瞬时荧光，

9、寿命与磷光相似波长同瞬时荧光，寿命与磷光相似 刚性、粘稠介质中刚性、粘稠介质中 E型型 T T1+ 活化能活化能 S S1 1S S0 0+ + h P 型型 T T1 + T T1 S S1 1 + + S S0 0 三重态三重态三重态粒子湮没三重态粒子湮没 S S0 0+ + h 寿命为相随磷光寿命的寿命为相随磷光寿命的 1/2 复合复合(重组）重组）A()+ h 1 A A( () ) + h 2 A A. .+ +( ( ) +) +e e 重组重组+e A()+ h 3 A A( ( ) ) 、荧光的一些基本问题、荧光的一些基本问题 a. 荧光类型荧光类型 (2)激发光与荧光波长比较

10、激发光与荧光波长比较 StokesStokes荧光（溶液中）荧光（溶液中） 荧荧激激 可能可能 AntistokesAntistokes荧光（高温稀薄气体中）荧光（高温稀薄气体中） 荧荧激激 共振荧光（气体、晶体中）共振荧光（气体、晶体中） 荧荧= =激激(3)荧光波长荧光波长 X X光荧光光荧光 紫外、可见荧光紫外、可见荧光 红外荧光红外荧光第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 、荧光的一些基本问题、荧光的一些基本问题 b.分子被激发时的散射问题分子被激发时的散射问题 激发激发光的能量光的能量太低、不足以外层电子跃迁到

11、太低、不足以外层电子跃迁到 S S1 1 但仍可将电子激发至基态的但仍可将电子激发至基态的高振动能级高振动能级上上 受激后能量无损失受激后能量无损失, 受激发后有能量改受激发后有能量改 瞬间瞬间(10-12) 返回原返回原 变变,返回原来稍高返回原来稍高 能级能级 或稍低能级上或稍低能级上 在不同方向上发射与原激在不同方向上发射与原激 不同方向伴随的波长不同方向伴随的波长 发光相同波长发光相同波长1 1的辐射的辐射 发射为发射为 1 1 瑞利散射瑞利散射 拉曼散射拉曼散射 特征：特征： 散射强度散射强度 1/ 1/4 4 （拉（拉) )强度强度 ( (瑞瑞) )强度强度( ( I IF F/1

12、000) /1000) 散射光波长激发光波长散射光波长激发光波长 拉曼带波长随激发光波长而变拉曼带波长随激发光波长而变 拉拉- F = 为定值为定值 反映了分子结构特性反映了分子结构特性第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 、荧光的一些基本问题、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱 (1) (1) 激发光谱激发光谱 (2) (2)荧光光谱荧光光谱 注意：注意：、实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异、实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异, ,其真实光其真实光谱必须要对其光源、单色器、检测器的光

13、谱特性加以校正谱必须要对其光源、单色器、检测器的光谱特性加以校正 、真实的激发光谱与吸收光谱非常近似，而不是相同、真实的激发光谱与吸收光谱非常近似，而不是相同第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 、荧光的一些基本问题、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱 (3) (3) 溶液荧光光谱的特征溶液荧光光谱的特征 斯托克斯位移（斯托克斯位移（ 荧荧激激 ） 原因原因 溶剂化效应溶剂化效应 h h h 非辐射损失非辐射损失荧光光谱与激发光波长无关系荧光光谱与激发光波长无关系 原因原因 荧光光谱与激发光谱

14、成镜像对称关系荧光光谱与激发光谱成镜像对称关系 光谱形状决定于光谱形状决定于S S1 1,S,S2 2的振动能级分布相似的振动能级分布相似第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 、荧光的一些基本问题、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱 (4) (4) 三维荧光光谱（总发光光谱、激发发射矩阵、等三维荧光光谱（总发光光谱、激发发射矩阵、等高线光谱）高线光谱） 给出三维信息给出三维信息 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 、荧

15、光的一些基本问题、荧光的一些基本问题 d.荧光物质的两个重要参数荧光物质的两个重要参数 (1)荧光分子的荧光分子的平均寿命平均寿命 各种单分子的非辐射去各种单分子的非辐射去 = 1 / ( kf +K ) 活化过速率常数之总和活化过速率常数之总和 荧光发射速率常数荧光发射速率常数 内在寿命内在寿命 0 （即（即K 时的时的 ） 0 = 1 / kf 荧光强度衰变荧光强度衰变 速率方程速率方程 It = I0 e - t / 或或 It = I0 - t / 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 、荧光的一些基本问题、荧光

16、的一些基本问题 d.荧光物质的两个重要参数荧光物质的两个重要参数 (2)荧光的量子产率荧光的量子产率 f 定义定义： 发射荧光的光子数吸收辐射的光子数发射荧光的光子数吸收辐射的光子数 f = kf / ( kf +K ) f (0.1(0.11)1)有使用价值有使用价值 注意注意： a. 荧光的能量产率荧光的能量产率eq= 荧光发射时的能量吸收的能量荧光发射时的能量吸收的能量 eq1 (红移红移) b. 荧光的量子效率荧光的量子效率 f = 处于发射荧光的激发电子态的分子的百处于发射荧光的激发电子态的分子的百分率分率 c. f, eq, f三个概念不同三个概念不同 第第1515章章 分子发光分

17、析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 4、荧光、磷光的测量、荧光、磷光的测量 一般荧光分光光度计与紫外可见区吸光光度计异同一般荧光分光光度计与紫外可见区吸光光度计异同 单束单束(光用于校正光用于校正) 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 4、荧光、磷光的测量、荧光、磷光的测量 荧光分光光度计荧光分光光度计 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 4、荧光、磷光的测量、荧光、磷光的测量a. 激光荧光光度计

18、激光荧光光度计 1975 Harrington 研制研制 输出、反射输出、反射 染料池染料池 样品池样品池 光栅光栅 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 4、荧光、磷光的测量、荧光、磷光的测量 b.电视荧光计电视荧光计 使用多色仪使用多色仪 Johnson设计设计 入射口狭缝入射口狭缝样品池长轴样品池长轴 波长复盖波长复盖 240 240nm nm 氙灯氙灯 无出射口狭缝无出射口狭缝 空间分辨空间分辨 1 1 nm nm 入射口狭缝入射口狭缝样品池长轴样品池长轴 时间分辨时间分辨14.7 14.7 ms ms 无出射口

19、狭缝无出射口狭缝 摄像管摄像管 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 4、荧光、磷光的测量、荧光、磷光的测量 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 5、影响荧光发射因素、影响荧光发射因素 a. 强荧光物质的结构特点强荧光物质的结构特点 （）（） 比比 n n 有利有利 f （）（） 共轭共轭 体系体系 f （）（） 刚性平面结构刚性平面结构 f （）（） 取代基影响取代基影响 给电子基团给电子基团 f 吸电子基团吸电子基团 f(p ) 取代基位置取

20、代基位置: :邻、对邻、对f 重原子取代基重原子取代基f ( p ) 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 5、影响荧光发射因素、影响荧光发射因素 b. 溶液环境因素溶液环境因素 （）溶剂（）溶剂 取决于荧光体和溶剂的化学结构取决于荧光体和溶剂的化学结构 ( ( 溶剂荧光物成化合物溶剂荧光物成化合物, ,荧光分子电离状态改变荧光分子电离状态改变) ) f.max f.max f 都都有影响有影响 重原子溶剂存在时重原子溶剂存在时 f(p ) 外重原子效应外重原子效应 （）温度（）温度 T f（）（）pH pH 平衡解离关

21、系存在平衡解离关系存在f.max f.max f 均有影响均有影响第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素光致发光及影响荧光发射因素 6、溶液荧光的猝灭、溶液荧光的猝灭 定义：定义：荧光分子与其它分子相互作用，改使荧光分子与其它分子相互作用，改使荧光强度下降。荧光强度下降。 猝灭过程实质题与发光过程相互竞争、缩短猝灭过程实质题与发光过程相互竞争、缩短发光分子激发态寿命的过程，具体形式机理各发光分子激发态寿命的过程，具体形式机理各不相同。不相同。 自学讲义内容自学讲义内容第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因

22、素光致发光及影响荧光发射因素1、常规方法、常规方法 a. 直接法直接法 b. 间接法间接法 与荧光试剂发生反应与荧光试剂发生反应 定量关系定量关系 If = 2.3 f I0b c（ b c 0.05 时）时） If = k c （ I0、b 不变）不变） 定量校正方法定量校正方法 外标法外标法 增量法增量法 2、荧光猝灭法、荧光猝灭法 F-会使会使8-羟基喹啉羟基喹啉铝配合物铝配合物 荧光强度荧光强度 , 测测F- 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法15-2 荧光分析法荧光分析法 3、动力学荧光分析法、动力学荧光分析法 反应物或产物中的荧光物质浓度变化，测荧光随时间变化求含量反应

23、物或产物中的荧光物质浓度变化，测荧光随时间变化求含量方法？方法？ Fe () + H+ + A Fe () + B dB/dt = A Fe () H+ 当当pH 一定一定 , A足够大足够大, 反应初期反应初期, 积分积分 B = Fe () t 又又 I fB = K B 则则 I fB = Fe () t 或或 I fB / t = Fe () Y = a x 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 荧光分析法荧光分析法 、荧光滴定法、荧光滴定法 鲁米诺指示剂鲁米诺指示剂 H H+ +时时 UVUV下下 兰荧光兰荧光 OHOH- -时时 UVUV下下 无荧光无荧光 、胶

24、束增敏荧光分析、胶束增敏荧光分析 荧光试剂荧光试剂 配合反应配合反应 优点：优点：a. a. 光学透明、稳定光学透明、稳定 b. b. 光化学上是非活性的光化学上是非活性的 c. c. 价廉、使用方便价廉、使用方便 d. d. 对荧光测量有对荧光测量有增溶、增敏、增稳增溶、增敏、增稳的独特性质的独特性质第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 荧光分析法荧光分析法A A、B B混合物在测量条件下，荧光光谱相互重叠混合物在测量条件下，荧光光谱相互重叠时，如何测量时，如何测量A A、B B 两物质？两物质？信息处理及仪器技术信息处理及仪器技术 6 6、双波长法（三波长法）、双波长法

25、（三波长法） 7 7、导数荧光法、导数荧光法 8、同步荧光光谱技术、同步荧光光谱技术 （同时利用（同时利用吸收吸收和和发射发射两个过程）两个过程）例例: :丁省乙醇溶液丁省乙醇溶液 荧荧- -激激= = 常数常数 = = 如何决定！如何决定！ Stoks Stoks 位移值位移值 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 荧光分析法荧光分析法简化光谱、窄化谱峰简化光谱、窄化谱峰8、同步荧光光谱技术、同步荧光光谱技术 * * *固定能量固定能量 (1/(1/激激-1/-1/荧荧) ) 10107 7 = = = = 常数常数 例例: : 芳环芳环 1400 1400 cmcm-1

26、 -1 振动带间隔振动带间隔* * * *可变角可变角 两者起始波长不同、两者起始波长不同、扫描速率扫描速率不同不同保持同一比例保持同一比例-线性线性测测c c 某一函数某一函数-非线性非线性 干扰干扰A A 免避散光免避散光 提高重叠体系分辨率提高重叠体系分辨率 激发波长激发波长 干扰干扰B B 发射波长发射波长 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 荧光分析法荧光分析法9、时间分辨荧光技术、时间分辨荧光技术 （利用（利用 寿命信息）寿命信息） 排除干扰排除干扰 应用应用 a. 荧光探针技术荧光探针技术 b. 单分子测量技术单分子测量技术 第第1515章章 分子发光分析法

27、分子发光分析法 15-2 荧光分析法荧光分析法1. 磷光与荧光的不同点表现在磷光与荧光的不同点表现在 a. a. 峰值波长峰值波长 P PF F b. b. p F c. c. p , I p 受重原子、顺磁性分子、离子存在受重原子、顺磁性分子、离子存在增强、敏感增强、敏感 F , IF 反之反之 2. 磷光测量方法磷光测量方法 a.a.与荧光测量类同与荧光测量类同 不同点：不同点： 固体样发射磷光、伴随发射荧光固体样发射磷光、伴随发射荧光 b. b. 如何解决如何解决 磷光磷光同同光源散射光源散射 磷光磷光同同 荧光荧光 分离开来分离开来 如旋转简磷光计如旋转简磷光计第第1515章章 分子发

28、光分析法分子发光分析法 15-3 磷光分析法磷光分析法2. 磷光测量方法磷光测量方法第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 磷光分析法磷光分析法3.常规（低温）磷光法常规（低温）磷光法 a. a. 为什么要低温测量？为什么要低温测量？ 减少非辐射跃迁对磷光发射影响减少非辐射跃迁对磷光发射影响 b. b. 如何实现低温测量？如何实现低温测量？ 液氮液氮7777K EPA K EPA 明净玻璃态明净玻璃态 c. c. 定量关系式定量关系式 （醚（醚 5 5：异戌烷：异戌烷 5 5乙醇乙醇 2 2） Ip = 2.3 pI0b c = Kpc 磷光的量子产率磷光的量子产率p： KS

29、T . . KP . KST +KF +Ki KP + Kj 与与S S1 1态态有关的非辐射跃速率（除有关的非辐射跃速率（除KST外）外） 与与T T1 1态态有关的非辐射跃迁速率有关的非辐射跃迁速率 d. d. 重原子效应的利用重原子效应的利用 灵敏度灵敏度 选择性选择性 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 磷光分析法磷光分析法4. 室温磷光法室温磷光法 a.a.为什么要引入室温磷光法为什么要引入室温磷光法? ? 常温法缺点：低温装置复杂常温法缺点：低温装置复杂 溶剂选择溶剂选择 操作难操作难 b.b.室温法要解决主要矛盾？室温法要解决主要矛盾？ 克服室温下克服室温下

30、 T TS S0 0 的非辐射跃迁的非辐射跃迁 使使I IP P 途径途径 固体表面室温磷光固体表面室温磷光 胶束稳定的溶液室温磷光胶束稳定的溶液室温磷光 19721972年年 1980 1980年年 固体载体固体载体 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 磷光分析法磷光分析法5.敏化溶液室温磷光法敏化溶液室温磷光法 一种间接的磷光分析法一种间接的磷光分析法 SD1 TD1 TA1 激发激发 IP SD0 S A0 能量供给体能量供给体D 能量受体能量受体A 被测物被测物 cx 无磷光或弱磷光无磷光或弱磷光 发磷光发磷光 IP IP =Kcx关键关键：选择能量受体选择能量受体A A * * D D 在在激发激发时时 A A 的的 A A 要小要小 * * TD1 TA1 * * A A 在所测溶剂中在所测溶剂中 pA 要大要大 A A：1 1，4 4二溴荼二溴荼6. 磷光分析应用磷光分析应用 多环芳烃多环芳烃 农药农药 生物碱生物碱 毒品毒品 药物药物 生物分子生物分子 第第1515章章 分子发光分析法分子发光分析法 15-2 磷光分析法磷光分析法1. 原理原理 R P* P+ h 或或 R P*+A A* A+ h 注意注意: : h h 是荧光是荧光 磷光磷光 2.