小鼠骨髓多染红细胞微核试验(氟化钠)

1、小鼠骨髓多染红细胞微核试验小鼠骨髓多染红细胞微核试验受试物：氟化钠受试物：氟化钠北京大学公共卫生学院 毒理学课程小组学习微核实验微核实验常用的致突变试验，细胞遗传损伤的指标之一，可用于染常用的致突变试验，细胞遗传损伤的指标之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测化学致突化学致突变物变物无着丝点断片无着丝点断片整个染色体整个染色体带着丝粒的环和断片带着丝粒的环和断片原理：原理：1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的点的染色体环和断染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中2 2断片断

2、片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质留在细胞质中中小鼠骨髓多染红细胞微核实验中小鼠骨髓多染红细胞微核实验中3.3. 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常叶及核突出物区分，故常计数计数PCEPCE细胞中的微核细胞中的微核，因为成红细，因为成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCEPCE，这些细胞保持其嗜，这些细胞保持其嗜碱性约碱性约2424小时，然后小时，然后成为成为NCE,NCE,并进入外周血

3、并进入外周血。4.4. 在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。因此，这些在细在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。因此，这些在细胞中没有主核，便于观察。观察并计数多染红细胞中的微核，胞中没有主核，便于观察。观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本试验的测试终点为染可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本试验的测试终点为染色体损伤。色体损伤。PCE：polychromatic erythrocyte,多染红细胞 NCE：normochromatic erythrocyte,正染红细胞试剂与器材试剂与器材（一）实验动物：成年小鼠成年小鼠（二）试剂： 受试物：氟化钠氟化钠

4、阳性对照物：环磷酰胺环磷酰胺、丝裂霉素C、三亚乙基密胺、甲磺酸乙酯、乙基亚硝基脲 小牛血清（使用前pH调至6.4） 甲醇 磷酸缓冲液 Giemsa（吉姆萨）染液：用时，将Giemsa原液用pH6.4的磷酸缓冲液1:10稀释（三）器材：（略）实验设计实验设计一一实验动物：实验动物：ICR小鼠，体重小鼠，体重18-22克，每组克，每组10只，雌雄各半，随只，雌雄各半，随机分组机分组二二剂量分组剂量分组：原则：原则： 最高剂量可选用动物的最大耐受剂量或最高剂量可选用动物的最大耐受剂量或化合物化合物LD50的的50% 不能引起明显的骨髓抑制，即不能引起明显的骨髓抑制，即PCE/(PCE+NCE)不低于

5、对照值的不低于对照值的20% （因为骨髓发生抑制时，外周血会发生反流）（因为骨髓发生抑制时，外周血会发生反流） 氟化钠：LD50=224.9mg/kg阴性对照组水受试物剂量组高剂量组224.9*50%=112.5mg/kg 中剂量组112.5*1/2=56.25mg/kg 或*1/4=28mg/kg低剂量组56.25*1/2=28.125mg/kg 或*1/4=7mg/kg阳性对照组环磷酰胺120mg/kg1/2 1/4 1/8 11.25mg/ml5.625mg/ml2.8125mg/ml0.1ml/10gNaF:90mg8ml11.25mg/ml4ml4+4ml5.625mg/ml4ml4

6、+4ml2.8125mg/ml三三. . 染毒途径：灌胃染毒途径：灌胃四四. . 染毒次数及骨髓采样时间染毒次数及骨髓采样时间 一次染毒、间隔24小时两次染毒、多次染毒 应于最大敏感期最大敏感期取样（预实验） 本次实习采用一次染毒，一次染毒，24小时后取样测定小时后取样测定操作步骤操作步骤24小时后制片染色镜检染毒取材取骨取骨擦净血污、剔去肌肉擦净血污、剔去肌肉剪去骨骺端剪去骨骺端小牛血清小牛血清混匀、推片混匀、推片吹干吹干甲醇中固定甲醇中固定2minGiemsa染色液染色染色液染色10-15minpH=6.4pH=6.4冲洗、晾干冲洗、晾干镜检、细胞计数镜检、细胞计数镜检 先在低倍镜下观察染

7、色及细胞分散情况，再以油镜计数 每例样本计数1000个个PCE，记录有微核细胞数，一个细胞中有几个微核时，记为一个有微核细胞。 再计数200个红细胞个红细胞，记录PCE在总红细胞（PCE+NCE）中的比例，作为对细胞毒性的指标多染红细胞多染红细胞 PCE正染红细胞正染红细胞 NCE微粒微粒浅兰色胞浆呈颗粒状油画淡红色胞浆呈均质状水彩画圆形或椭圆形边缘光滑染色与有核细胞的核一致，紫红色大小约为红细胞的1/20-1/5MNMNNCE图 1 ：正常嗜多染红细胞 PCE （ 400 ） 图 2 带微核嗜多染红细胞 MNPCE （ 400）结果分析与评价受试物剂量（mg/kg）各受试小鼠1000个受检细

8、胞中含微核细胞数总计12345678910NaF112.556.2528.125水0.1ml/10g环磷酰胺120受试物剂量（mg/kg) 受检细胞总数（个） 含微核细胞数（个）平均微核千分率（）标准误NaF112.5100056.25100028.1251000水0.1ml/10g1000环磷酰胺1201000结果分析与评价受试物剂量（mg/kg）各受试小鼠200个红细胞中含PCE数量总PCE总PCE/200012345678910NaF112.556.2528.125水0.1ml/10g环磷酰胺120结果分析与评价 用统计学方法检验微核细胞率的差别 Kastenbaum-Bowman统计检验表统计检验表 泊松分布泊松分布 二项分布二项分布 t检验检验 单因素方差分析 一元线性回归分析结果分析与评价 结果判定：实验组微核细胞率比对照组有显著增加，并有剂量反应关系，可认为是阳性结果。阴性对照组小鼠的微核细胞率一般不超过3。若微核发生在雌雄间有明显差异时，需按照性别分别进行统计分析。PCE/(PCE+NCE)不低于对照值的20%PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PC