生物技术在医药和农业领域的应用

1、 “生命科学导论”系列讲座（9）文化素质教育课程n 了解现代生物技术的原理和方法及其在农业和医药领域的广泛运用。认识医学领域是现代生物技术应用最广泛、成绩最显著、发展最迅速的领域。了解生物技术对疫苗生产、疾病诊断和治疗、生物制药等领域的影响；了解生物技术对人类健康、延长人类寿命、提高生活质量所具有的不可估量的作用。n 认识生物技术在培育高产、抗病、抗逆植物新品系以及在培育优良生产性能动物新品系、动物快速繁殖、生物反应器等领域的应用。学习目的学习目的 1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务

2、的技术。 美国政府技术顾问委员会(OAT) 的定义是：应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。生物技术的定义：生物技术特点： 以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段（基因工程、细胞工程）和其它基础学科的科学原理，按照预先的设计，改造生物体，为人类生产出所需的产品（医药、高产优质粮食）或达到某种目的（预防、诊断和治疗疾病）的技术。高技术（精细和密集）、高投入、高利润 基因工程、细胞工程、微生物工程、蛋白质（酶）工程： 此外，基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术等。 直接相

3、关联的学科： 分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、化学工程学、医药学等。 对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域： 医药生物技术、农业生物技术、环境生物技术、 海洋生物技术等。生物技术的主要内容： 将病原物（如细菌、立克次体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的，可以通过注射或黏膜途径接种，并诱导机体产生针对特定致病原的特异抗体或细胞免疫，从而使机体获得消灭该病原能力的生物制品统称为疫苗。包括蛋白质、核酸、活载体或感染因子等。（一）生物技术与疫苗 1. 1. 疫苗疫苗的定义的定义众所周知,利用疫苗主动预防传染性疾病的最有效手段之一.疫苗对人类

4、健康作出巨大贡献.静止TH 细胞致敏淋巴细胞 2. 2. 疫苗的作用原理疫苗的作用原理细胞免疫体液免疫免疫系统的“信号处理器”，捕获抗原、加工抗原信息、传递抗原信息。带有致病原信息的抗原成分,进入机体后被机体识别,继而加工成抗原信息 灭活疫苗灭活疫苗：主要成分是经过灭活的病毒颗粒、细菌或寄生虫。主要成分是经过灭活的病毒颗粒、细菌或寄生虫。病原完全丧失感染性但保留部分免疫原性。病原完全丧失感染性但保留部分免疫原性。 免疫原性稳定，易于制备多价疫苗，工艺简单。但对机体刺激时间短、免疫持续时间较短；有发热过敏反应等。如：百白破疫苗、伤寒疫苗、脊髓灰质炎疫苗、霍乱疫苗、狂犬疫苗等。 减毒活疫苗：减毒活

5、疫苗：用毒力弱或基本无毒的活微生物制成。接种后用毒力弱或基本无毒的活微生物制成。接种后在体内可生长繁殖，免疫力持久。在体内可生长繁殖，免疫力持久。 原理：接种疫苗后使人产生亚临床症状，模拟自然感染后的免疫过程。持久，广谱免疫应答，工艺简单，低廉。残余毒力和减毒不足后果严重，需要低温保存。如卡介苗（BCG）、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、乙型脑炎减毒疫苗等。 亚单位疫苗：亚单位疫苗：去除病原体中有害成分，保留能引起特异性免去除病原体中有害成分，保留能引起特异性免疫反应的有效成分（蛋白质、多肽和多糖等）制成的疫苗。疫反应的有效成分（蛋白质、多肽和多糖等）制成的疫苗。 安全、无不良反应；分子量小，免疫原

6、性较弱。如流感病毒血凝素疫苗, 脑膜炎球菌夹膜多糖疫苗。 3. 3. 疫苗的种类和特点疫苗的种类和特点第一代疫苗特点：以减毒、弱化或灭活的病原体做疫苗。特点：以减毒、弱化或灭活的病原体做疫苗。1982年，乙肝疫苗首次在美国上市，为灭活疫苗。受血液来源和技术的限制，数量少、价格高，难于推广。由于是血源制品，安全也无保障。 第三代疫苗 ：核酸疫苗（DNA疫苗、基因疫苗）。指将含有编码病原体抗原基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。 特点：用含有病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗

7、，当引入机体后并不与宿主CS整合，而是通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主细胞产生特异性免疫应答。 法国首先用基因工程方法在细菌和小鼠细胞中诱导产生乙肝病毒的蛋白质，并证明有免疫原性。后克隆乙肝表面抗原（HBsAg）基因，并获得大量的表面抗原。 1986年美国FDA首先批准Merck公司基因工程疫苗（酵母表达系统）上市。 第二代疫苗：基因工程疫苗。将病原体的抗原（某种蛋白质）基因克隆在细菌或真核细胞内，使病原体的主要抗原基因在细菌或真核真核细胞中表达，利用表达的蛋白质或多肽作为疫苗。 特点：利用病原体的某些抗原成分作为疫苗。用于不能或难培养的、危险性大的病原物。制备成本低廉，易发展多价

8、疫苗。 核酸疫苗（核酸疫苗（DNADNA疫苗、基因疫苗）疫苗、基因疫苗） 1990年，Wolff首先报道了小鼠肌肉注射质粒DNA，质粒及其携带的基因可以被细胞摄取并表达。 所谓核酸疫苗是将含有编码蛋白质基因序列的 质粒载体，经过肌肉注射或微弹轰击等导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主对该抗原的 免疫应答，达到预防和治疗目的。 这种疫苗兼有基因工程疫苗的安全性和减毒活疫苗激发机体强免疫反应的双重性，且免疫效果持久、制备简单、低廉等优点。（二）生物技术与疾病诊断要求要求：早期、特异、快速、灵敏、操作简便早期、特异、快速、灵敏、操作简便v 1. 1. ELISAELISA技术技术v

9、2. DNA2. DNA诊断技术诊断技术v 3. 3. 生物芯片与生物芯片与疾病疾病诊断诊断 疾病的诊断对其治疗起决定作用。传统的传染病诊断技术是依据临床症状的表现来判断，有一定局限性；通过微生物培养、形态检查、生理生化检测确定病原物，费时。 ELISAELISA原理：原理：将酶与抗体（原）交联形成酶-抗体(原)复合物（常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)或脲酶等）；另外将抗原（体）吸附在以聚苯乙稀制成的微孔滴定板上，使之固相化，免疫反应和酶促反应均在其中进行。利用抗原与抗体的特异结合以及酶将无色底物催化成有色底物，根据底物颜色的有无以及颜色的深浅判断阴性或阳性反应以及反应

10、强度。1.1 1.1 酶联免疫吸附检测（酶联免疫吸附检测（ELISAELISA）技术）技术底物酶标Ab产物待检样本（特异Ab）测定抗体的间接测定抗体的间接ELISAELISA法法测定抗原的双抗体夹心法测定抗原的双抗体夹心法受检样品中的抗原已知病原物特异用被检抗原免疫动物获得的Ab I 用抗原免疫另一动物获得的特异Ab I酶标Abn基因工程抗原：基因工程抗原：如疫苗生产一样，将如疫苗生产一样，将抗原基因抗原基因克隆克隆在在细菌细菌或或真核细胞真核细胞表达系统中，由这些表达系统生产大量的抗原。表达系统中，由这些表达系统生产大量的抗原。间接ELISA法测定抗体必需首先制备大量的抗原，并将之包被于微孔

11、板上。传统的抗原制备方法一般有两种传统的抗原制备方法一般有两种危险、质量难以控制，难以标准化生产过程不必接触病原体，也便于标准化生产，成本低廉。n抗体的制备可以将上述制备的抗原直接免疫动物，在被免疫的动物的血清中将会含有相应的抗体，通过一系列的纯化技术就可获得相应的抗体。n由于一个抗原往往会有多个抗原决定簇，故由此方法制备的抗体是一种含有可分别与多个抗原决定簇结合的多种抗体的混合物，这种混合物称之为多克隆抗体。多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体主要缺点主要缺点： 特异性较低特异性较低：不同病原体间可能会有相似的抗原决定簇，假阳性率较高不同病原体间可能会有相似的抗原决定簇，假阳性率较高

12、 ； 质量难于控制质量难于控制：被免疫的动物的个体差异被免疫的动物的个体差异 ，各批次的抗体间有差异，各批次的抗体间有差异 ； 成本高成本高。 ELISA技术除了要制备抗原检测抗体外，有时还需制备抗体，用于检测抗原。 单克隆抗体是利用细胞融合技术，在体外大量培单克隆抗体是利用细胞融合技术，在体外大量培养融合细胞，由融合细胞产生大量的抗体。养融合细胞，由融合细胞产生大量的抗体。 由于单克隆抗体只识别某一特定的抗原决定簇，由于单克隆抗体只识别某一特定的抗原决定簇，所以它具有所以它具有特异性强特异性强、成分均一成分均一、灵敏度高灵敏度高、产产量大量大、容易标准化生产容易标准化生产等优点而明显优于多克

13、隆等优点而明显优于多克隆抗体。抗体。单克隆抗体单克隆抗体 免疫淋巴细胞和骨髓瘤细胞的制备 两种细胞的融合 从融合细胞中筛选出杂交瘤细胞 特异杂交瘤细胞的克隆化 特异杂交瘤细胞生产特异抗体（单克隆抗体）单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体的单克隆抗体的应用范围应用范围n 鉴定微生物病原体 包括临床诊断以及食品、环境等可 能污染物的病原体检验。n 确定激素水平 用于评价内分泌功能以及妊娠试验，特别是早孕的检验。n 检测肿瘤相关蛋白质 通过检测与肿瘤相关的蛋白质，如癌胚抗原、甲胎蛋白等。对肿瘤进行早期诊断以及治疗后的疗效评价。n 检验血液中的药物含量 包括检测违禁药物，检测治疗药物如庆大霉素、环孢素等的浓

14、度以确定最佳用药量。n 肿瘤治疗 将肿瘤治疗药物结合到抗肿瘤的特异单克隆抗体上，制成所谓的生物导弹，利用抗体与肿瘤的特异结合能力，使药物集中到肿瘤部位，减少药物的副作用。2.1 基因诊断概述 基因诊断（DNADNA诊断诊断）的概念：根据DNA分子碱基互补配对及变性、复性的原理，利用基因探针杂交、基因体外扩增（PCR）、电泳、DNA测序以及差异显示等分子生物学技术，通过直接检查基因的存在状况及其功能（基因型的改变）对疾病作出判断的诊断技术。 蛋白质蛋白质是生命的体现者，DNADNA是遗传的物质基础，基因基因是DNA分子上的功能片段，是遗传的基本单位。 人类患各种疾病很大程度是由于执行某一功能的蛋

15、白质分子出现异常。而这种不同和异常取决于控制其合成的基因的不同和异常。 传统的疾病诊断是以疾病或病原物的表型为依据。 如果能够在基因水平直接检测与某种疾病相关的基因序列，或病原物的特异性基因片段，则可以克服传统诊断的不足，从根本上对疾病作出诊断。 基因诊断基因诊断是继是继生化指标诊断生化指标诊断、免疫学诊断免疫学诊断之后的第之后的第三代诊断技术。三代诊断技术。2.2 主要的基因诊断技术2.2.1基因探针杂交技术病原物提取病原物DNADNA固定在硝酸纤维膜根据病原物特异DNA序列合成探针用荧光素标记探针探针与膜上探针与膜上DNADNA退火退火根据是否检测到荧光来判断是否有探针所代表的病原物检测病

16、人分离标本基本思路：基本思路：将已知序列的特定基因（微生物、遗传病的特异基因片段）用同位素、荧光素等标记，制备成一种诊断试剂诊断试剂，即基基因探针因探针。由于其在适当条件下可与同源序列互补形成杂交体，因此使基因探针与待检测组织细胞内的基因片段发生杂交反应，通过探针上的标记观察探针是否与标本DNA结合，从而判断标本是否有与探针一致的片段，再对是否有遗传病或病原物感染作出诊断。诊断试剂2.2.2 利用PCR或PCR与分子杂交标记结合技术基本思路基本思路：寻找病原体的特异DNA序列，以该段DNA序列作为靶序列设计特异性引物；对待测样品进行PCR扩增，然后检测相应的扩增条带，有则为阳性反应。应用应用：

17、已经应用于结核杆菌、淋球菌、多种致腹泻的肠道传染细菌、人类免疫缺陷病毒、乙肝病毒等的检测。产前诊断、血源筛查、肿瘤基因诊断。PCRPCR（聚合酶链反应）技术（聚合酶链反应）技术：体外扩增特异DNA片段的技术。用于基因工程的基因制备，还用于某些疾病的诊断。目前大多数遗传病无有效的治疗方法，因此产前诊断对于降低遗传病的发病率，提高人口素质具有重要的意义。例如，一种由基因点突变导致常染色体退化的遗传病镰状红细胞贫血症的检测。 夫妇之一有染色体畸变。 35岁以上的高龄产妇。 夫妇之一有开放性神经管畸形。 夫妇之一有先天性代谢缺陷。 X-连锁遗传病基因携带者孕妇。 有原因不明的习惯性流产的孕妇。 羊水过

18、多的孕妇。 夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇。 有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。需要进行产前诊断的对象羊水和胎盘绒毛膜检测生物芯片技术用于诊断的一般原理 生物芯片又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。 1996年，美国 Affymetrix 结合照相平板印刷、计算机、半导体、寡核苷酸合成、荧光标记、核酸探针分子杂交和激光共聚扫描等技术，研制了世界第一块DNA芯片。 从生物样品（血液或活组织）中分离纯化DNA

19、或mRNA，并对其进行特异性扩增；对待测样品进行标记（通常用荧光素标记的dNTP为底物，通过PCR使之进入新合成的DNA片段中）；标记好的DNA样品与DNA芯片进行杂交，由于有大量DNA探针集成在芯片上，故可以一次检测大量生物样品；杂交后漂洗去除未杂交的DNA分子；携带荧光标记的样品结合在特定位置上，在激光激发下会发荧光。A.用于微阵列芯片制作的点样仪；B.封装在卡盒中的微阵列芯片; C.用于微阵列芯片荧光标记检测的激光共聚焦扫描器；D.微阵列芯片的局部放大；E.微阵列芯片上固定DNA探针的示意图。图中蓝色的DNA链是预先固定在芯片表面的捕获探针，红色的DNA链是与捕获探针互补的靶DNA分子。

20、DNA芯片利用芯片利用DNA杂交反应杂交反应生物芯片生物芯片 用平面微细加工技术,实现大批量生产。通过提高集成度,降低成本。 可组装大量的 (104106种)生物分子探针,获取信息量大,效率高。 结合微机械技术,可把生物样品的预处理,基因物质的提取、扩增,以及杂交后的信息检测集成为可以随身携带的微型（芯片）实验室,制备成微型、全自动化、可用于微量试样检测的高度集成的智能化生物芯片。每个点上有已知的DNA探针 DNA芯片可用于大规模筛查基因突变所引起的疾病；检查肿瘤组织基因表达谱、寻找肿瘤相关基因、肿瘤基因突变的研究。将许多代表每种微生物的特殊基因制成1张芯片，判断病人感染病原体的种类。 分析基

21、因组及发现新基因等具有很大的优势；DNA芯片技术用于基因组分析时，具有样品用量小、信息量大、分析方法简易快速、自动化程度高等多项优点，特别适合于寻找新基因、基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。 医学、化学、新药开发、司法鉴定、农业技术和食品技术领域也具有广泛的应用。生物芯片在诊断上的应用 1998年，美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一。（三）生物技术与疾病治疗 生物治疗是用生物治疗是用生物来源的制剂生物来源的制剂或或调节人体生物反应的制剂调节人体生物反应的制剂（如细胞因子、（如细胞因子、免疫活性细胞、干细胞、单克隆抗体和变

22、应原蛋白等）治疗疾病的方法。免疫活性细胞、干细胞、单克隆抗体和变应原蛋白等）治疗疾病的方法。 1. 1. 生物治疗概述生物治疗概述 2. 2. 常见的生物治疗技术常见的生物治疗技术 指将目的基因导入靶细胞以后与宿主细胞内的基因发生重组，成为宿主细胞的一部分，从而可以稳定地遗传下去并达到对疾病进行治疗的目的。 近年来采用基因工程技术，即使目的基因和宿主细胞内的基因不发生重组，目的基因也能得到暂时的表达，又将其称为基因疗法。基因治疗采取的措施基因治疗采取的措施 根据对宿主病变基因的不同，可分为： 基因置换：用正常的基因整个地替代突变基因，使突变基因永久地得到更正； 基因修正：将突变基因的突变碱基序

23、列用正常的序列加以纠正，而其余未突变的正常部分予以保留； 基因修饰：将目的基因导入宿主细胞，利用目的基因的表达产物来改变宿主细胞的功能，或使原有功能得到加强； 基因失活：利用反义技术来封闭某些基因的表达，以达到抑制有害基因表达的目的。基因治疗的疾病类型基因治疗的疾病类型 遗传性疾病的基因治疗 肿瘤的基因治疗 传染性疾病的基因治疗等 2.1 2.1 基因治疗正常的人类基因可以克隆并引入遗传病患者的体细胞，以替代、修复或纠正有缺陷的基因。通常使用一种反转录病毒作为基因治疗的转移系统，重组载体可以感染人的组织和细胞，但不自我复制。转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织中治疗1991年，美国批准第一例对遗

24、传病进行体细胞基因治疗方案。即将腺苷脱氨酶（ADA）基因导入4岁女患童体内。过程：过程：先将人正常的ADA基因构构建建到反转录病毒载体上，然后用该载体转染转染患儿的白细胞，并用IL-2刺激细胞增殖增殖。10天左右，白细胞在体外大量扩增，再经静脉输入输入患儿体内。 2.2 2.2 干细胞技术干细胞干细胞(stem cell)一一词中的词中的“干干”译自译自“stem”，意为意为“树干树干”、“主干主干”，以示该类细胞在所有细胞中以示该类细胞在所有细胞中的地位。就像的地位。就像树的主干能生树的主干能生长出无数形态各异的枝桠一长出无数形态各异的枝桠一样，干细胞可以分化为很多样，干细胞可以分化为很多形

25、态和功能各异的细胞群。形态和功能各异的细胞群。 因此，因此，干细胞是一类具干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的原有自我更新和分化潜能的原始细胞，是形成人体各种组始细胞，是形成人体各种组织、器官的祖先织、器官的祖先。 正常体细胞是高度分化的、具有独特功能的细胞，这种细胞完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。为了补充死亡细胞，机体保留一部分干细胞。一旦需要，这些干细胞可按照一定途径分裂、分化为具有一定功能的成熟细胞。如：人红细胞平均寿命120天，新的红细胞来源于造血干细胞，它能分化为红细胞、白细胞、巨噬细胞等各类细胞。n 全能干细胞：具有完整的分化潜能，能分化形成生物的个体。n 多能干细胞：具有多

26、种分化潜能，能分化成多种单能干细胞。n 专能干细胞 ：2.1.1 2.1.1 干细胞的分类胚胎干细胞：胚胎发育早期（桑椹胚）尚未分化、具有各种分化潜能的并可以发育为各种器官和组织的细胞。n 组织干细胞：位于成体的组织和器官中，可以定向分化为一种组织。成年动物的表皮 和造血系统具有修复和再生能力。此外，肝脏、胰腺和神经细胞也有这种特性。成体干细胞： 干细胞存在于早期胚胎、骨髓、脐 带、胎盘和成年人的部分组织和器官中。它能够发育成肌肉、血液、肝脏、骨髓和神经等多种人体组织和器官。 按组织来源分按组织来源分： 按分化潜能来分：按分化潜能来分：目前，造血干细胞是所有干细胞中目前，造血干细胞是所有干细胞

27、中研究最多研究最多、技术最成熟技术最成熟、应用最广泛应用最广泛的的一种干细胞。一种干细胞。造血干细胞移植造血干细胞移植已经成为根治已经成为根治白血病白血病等血液系统疾病、等血液系统疾病、恶性恶性肿瘤肿瘤、遗传病遗传病、顽固性自身免疫性疾病顽固性自身免疫性疾病和和严重免疫缺陷疾病严重免疫缺陷疾病等等的主要治疗的主要治疗手段。手段。造血干细胞移植造血干细胞移植: 泛指将各种正常来源的造血干细胞移植到患者的体内，使其产生正常血细胞的技术。移植时先要使患者接受超剂量化疗，放疗，以消灭体内的 肿瘤细胞等异常细胞（包括造血和免疫系统）。然后将供者的正常干细胞通过静脉输注移植入受者体内，使正常的造血与免疫功

28、能得以重建，从而根治疾病。 临床移植的造血干细胞主要有三个来源：骨髓（造血干细胞的临床移植的造血干细胞主要有三个来源：骨髓（造血干细胞的80%80%），外），外周血和脐带血。周血和脐带血。外周血外周血造血干细胞移植：造血干细胞移植：指从从外周血液中分离得到的造血干细胞进行移植。采集方便；受者免疫功能恢复快；感染出血等并发症低且轻，减少抗生素等用药；肿瘤已经浸润骨髓的供体也可以施行；外周血中肿瘤细胞混入少，移植后复发率低于骨髓移植。 捐献造血干细胞已经成为一个国家文明程度的标志之一。 存在于造血组织中的一群具特定分化潜能的原始造血细胞,可分化为红系,粒系,巨核系等造血祖细胞,并进一步分化产生红细胞，粒细胞，单核细胞，淋巴细胞及血小板等所有血液细胞。 2.1.2 2.1.2 干细胞的应用前景2.1.2.1 2.1.2.1 造血干细胞造血干细胞 从兔子的眼角膜中分离出从兔子的眼角膜中分离出