基因工程综合分析题

1、综合题 基因工程综合分析题1、种子在储藏过程中发生了某种变化，使得长成的水稻很容易被一种病原菌感染。据推测可能是某一化学诱导的突变导致的一个具有抗菌功能的关键酶丢失。请设计一个实验验证这种推测是否正确，如何使种了重新获得对这种病的抗性？1、答：将敏感植株与抗性植株杂交后观察其后代的分离模式，判断功能的缺失与显性是否有关。通过mRN差异显示分析可鉴定敏感植侏与抗性植株基因组之间的表达差异。将获得的差示cDNA插入根癌农杆菌的Ti质粒，通过转化导入敏感植株中。这样即可通过反式互补获得目的的基因克隆。该基因可以作为分子探针，通过杂交分离出野生型和突变型的基因座，由此鉴定突变体的特性，最终可以通过“基

2、因治疗”的方式恢复抗性。2、一个人类疾病基因定位在7号染色体一段140kb的区域内，并已分离到此染色体区段的克隆，但是并不知道该基因定位在此区域的哪一位置。可用什么方法找到该基因？2、答：将140Kb的克隆片段分成一系更更小的片段，以每一个片段作为探针对其他哺乳动物的DNA进行动物印迹实验，种间保守的片段将出现信号；这些片段 可能编码外显子。用外显子片段作为 Southern印迹实验的探针来检测带病病人DNA，通常，遗传性疾病都是因为重要基因内的DNA发生了变化所致。如果病人的DNA与对照DNA的某一片段有着不同的杂交类型，那么这一片段很可能与疾病有关。从病人和正常对照组中分离RNA，用这一片

3、段作为探针进行Northern杂交。如果病人和对照组的RNA的总量不同，则这一片段很可能包含致病的基因。3、如何以大肠菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。3、答：要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：（1）细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动。（2）大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成熟Mrna。细菌细胞没有必要的机制来去除内含子。（3）有些真核生物的蛋白质是通过前体分子加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两

4、段肽链分别形成胰岛素的、链。（4）产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：应该将激素的编序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近（含有这种序列的载体称表达载体）。可以以激素的mRNA 为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起码密码ATC、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及12个终止密码：ATC编码序列TGA TAG现在，这个合成基因可被插入载体中。有时加工过程可以在离体条件下进行。

5、如果加工有因难，可以用合成基因，从而免除加工过程。选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。说明：1）ATG、TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG，UGA的DNA序列。2）克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长素释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素，长14个氨基酸残基，因此人工合成的基因，包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号，仅51bp长。4、用Bam H I 切割一重组质粒DNA分子并从中分离纯化了两个DNA片段，一段长400bp，

6、另一段长900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来，得到如图221所示的结果。于是将这两种片段混合起来，并在连接酶的存在下进行温育，分别在30分钟和8小时取样进行凝胶电泳分析，令人惊讶的是，连接产物并非是理想中的13kb的重组分子，而是一种复杂的片段模式（图222A）。同时发现随着温育时间的延长，较小片段的浓度逐渐降低，大片段的浓度逐渐增加。如果用Bam H I 来切割连接后的混合物，则起始的片段可以重新产生（图2122A）从凝胶中分离纯化出13kb的片段，并取出一部分用 Bam HI 进行切割，以检查它的结构。正如预料的一样，出现了两个原始的带（图222B）。但是用EcoR I 切割另一部

7、分样品，希望能够产生两个300bp和一个长度为700bp的核苷酸片段，然而，凝胶电泳的结果，令人惊奇（图222B）（1）在原始连接混合物中为什么有如此多的带？（2）为什么用Eco R I切割纯化的13kb连接物会产生那么多的片段？4、答：（1）由于任意两个BamH I位点都可以连接在一起，产生的连接产物就很复杂。因此，04kb 的片段连接一起可以产生诸如0.8kb、1.2kb、 1.6kb、 2.0kb等等一系列的片段。同样，0.9kb 的片段也可以产生1.8kb、2.7kb 、3.6kb等系列片段。将这两套片段放在一起，可以生产1.3kb、 1.7kb 、2.1kb 、3.6kb等系列片段。

8、将这两套片段放在一起，可以生产1.3kb 、1.7kb、 2.1kb和 2.2kb等片段。（实际情况更复杂，因为片段自身可以首尾连接成环）。（2）由于任意两个BamH I末关可以连接，甚至同一大小的片段也有几种不同的结构（如图A22.1中的1.3kb片段的群体，可以产生各种不同大小的片段，范围可以从0.1kb（图A22.1中结构3和4左端）到1.0kb（图A22.1的结构4中的内部片段。）5、四膜虫是一种双核有纤毛的原生动物。小核（微核）含有细胞染色体主要拷贝，它参与细胞的性接合，而并不在通常的基因表达中起作用。大核（巨核）含有细胞基因组的“工作”拷贝，由大量基因大小的双链DNA片段（微染色体

9、）组成，它们活跃地进行着转录。含有核糖体RNA基因的微染色体拷贝数很多，可以用梯度离心进行分离。在电子显微镜下检查，每一个核糖体微染色体是一种长为21kb的线性结构。进行凝胶电泳时，核糖体微染色体的迁移也是21kb （图223的第一泳道）。但是，如果用限制性内切核酸酶Bgl的切割微染色体，产生的两个片段（134kb和38kb）的总和不等于21kb（图223的第二泳道）改用其他的限制性内切核酸酶切割，所产生的限制性片段的总和也都小于21kb，并且不同种酶切割产生的片段总和都不一样。如果把未经切割的微染色体先进行变性和复性处理，然后再进行凝胶电泳，所得到的双链DNA片段只有215kb（图223第三

10、道）；与此相似的是，将Bgl切割的微染色体进行变性和复性，电泳后，134kb的片段被67kb的片段所取代（图223第三泳道）；与此相似的是，将Bgl切割的微染色体进行变性和复性，电泳后，134kb的片段被67kb的片段所取代（图223第四泳道）。请解释为什么限制性片段的总长度不等于21kb？为什么变性和复性之后电泳的结果有所改变？对于核糖微染色体中的总序列组成你有什么看法？5、答：限制性内切核酸酶片段的长度不会达到的21kb ，且电泳的方式也会随变性和复性而变化，这是因为核糖体微染色体是一种反向的二聚体或一种回文结松（图A22.2）。也 就是说，微染色体的左半部分的序列是同右半部分的序列在方向

11、上是反向重复的。因此，一种限制性内切核酸酶是在与末端相同距离的位点切割每一条臂（即每一重复片段），结果产生一个中央片段和两相相同的两侧末端片段。用Bgl切割，中央片段是13.4kb，两侧末端片段各为3.8kb。凝胶上的各片段之和不到21kb，应该末端计算两次，即2×3.8kb+13.4kb=21kb、微染色体或其切割后的产物经变性和复性，会改变电泳的结果，这是因为来自中央片段的单链的左右两半是互补的，可以自身复性。由于两个互补的片段是相同的分子，其自身复性比与其他分子间的复性速度要快很多。自身复性将产生的片段的可见长度减少12，因此，将未切割的微染色体进行变性和复性，其大小从21kb

12、减少到10.5kb。同样，13.4kb 的中央Bgl片段被减少到6.kb 。当然，末端单链片段不自身互补，只能与其他的互补片段重新形成它们通常的双链结构。出乎意料的是，四膜虫核糖体基因存在于一个小核的染色体中，大小只有构成大核微型染色体反向重复序列的一半。因为接合后小核产生新大核，所以核糖体基因必须从染色体中切割出来，切出的方式必须是能够特异性地形成反向二聚体。在查阅从事此项研究工作的科学家们是如何推测之前，请你思考应如何完成该项研究。6、X染色体的失活是一种独特的发育调挖机制，它关闭了整个染色体上所有基因的表达。在人类X染色体中，失活作用涉及到15×188以上的碱基对和几千个基因。

13、在女性中，两条X染色中的任何一条失活所造成的X连锁基因的表达与正常男性单个X染色体上基因表达的结果是相同的。虽然人活的机理仍不了解，一般认为失活作用是在染色体的特写区域即X失活中心开始的，然后扩散到染色体的其他部分。虽然染色体上的大多数基因被关闭了，但少数仍有活性，因此，可以推测X的失活作用与X连锁基因的表达模式有关。为了验证这种推测，分离了大量的人的X染色体基因的cDNA并用Norhtern印迹法检查它们的表达。比较了这些基因在X染色体正常的男性女性细胞中的表达、在X染色体异常的男性和女性个体中的表达、以及在啮齿动物：人细胞杂交株中的表达，这种杂交株保留了一个失活的人的X染色体（Xi ）或是

14、一个有活性的人X染色体（Xa）在四种cDNA中，发现了三种表达模式，A、B、C三种cDNA示于图224图224来自于不同细胞中不同数目、不同类型X染色体的Nothern印迹分析RNA先进行凝胶分离，吸印到硝酸纤维素膜上，同A、B、C三种cDNA混合探针进行杂交，最后进行放射自显影。对应于基因A、B、C的RNA带的位置是通过不同实验测定的。（1）指出每一种表达模式中表达的基因是来自于活性染色体、非活性染色体，还是二都都有。哪一种是最普遍的，哪一种是最特殊的？（2）根据不正常个体细胞的结果，归纳出一条规律以说明在X染色体失活过程中，有多少染色体被失活，多少保留活性。6、答：（1）根据基因A在雄性和

15、雌性中的等量表达以及在杂种细胞中的表达情况看，基因A只在活性的X染色体上表达。根据基因B在杂种细胞系中的表达中果，以及在与X染色体总数相关的其他细胞的表达水平，基因B在活性或非活性的X细胞系中的表达情况看，基因C只在雌性而不在雄性细胞中表达，以及在杂种细胞系中的表达情况看，基因C只在无活性的X染色体上表达。基因A的表达方式是最普通的，失活染色体上的绝大多数基因都被关闭了；只有像基因B这样的少数基因才能在有活性和无活性的X染色休上进行表达。基因C的表达模式令人诧异。现在知道只有一个基因（叫做XIST即X特异转录）是这种表达模式。值得注意的是，该基因位于失活染色体中心的附近，并在染色体失活过程中起

16、直接的作用。（2）X染色体失活的规律是：只有一个X染色体保留活性，其余的全部失活。在图22.4所示的 Northern 印迹分析中可以看到这种规律。无论染色体的数目有多少，在活性X染色体上表达的基因A总是以恒定的水平进行表达，这就表明只有一个X染色体保留了活性。相反，只在失活染色体上表达的基因C只是在那些含有一个以上X染色体的细胞中表达，并且X染色体的数目决定其表达水平。失活染色体表达的这些规律是在分子生物学技术出现前很久，从细胞生物学的观察中总结出来的。由于失活X染色体是高度浓缩的，在核中，作为明显可分的实体即Barr小体很容易被观察到。很早就注意到，雌性细胞有一个Barr小体，雄性细胞没有

17、Barr小体。含有过多X染色体的异常个体有很多Barr小体，其数目等于X染色体数目减一。7、许多引起人遗传病的突变都是由单个核苷酸的取代而造成的。寡聚核苷酸的连接作用可提供一个快速检测核苷酸差异的手段。这种分析方法要使成对的寡聚核苷酸：其中一个被生物标记，另一个具有放射性标记或荧光标记，图225B匠一对寡聚核苷酸是为了检测镰形细胞白血病（图225A）而设计的。在分析过程中，分别将不同个体的DNA在有DNA连接酶的存在下，两两配对进行寡聚核苷酸杂交。将生物素酰化的寡聚核苷结合到固相支持物的抗生物素链霉蛋白上，然后通过放射自显影检查杂交结果，如图224C所示。 （1）你认为A与S寡聚核苷酸会同时与

18、ASDNA杂交吗？（2）这种分析是怎样区别ASDNA的？7、答：（1）两个寡聚核苷酸都会同A和ADNA杂交。例如，oligoA同A完全匹配（20配20），同SDNA有19个相配。oligoS的情况也是如此。除非是严格地选择杂交条件，匹配20同配19间的杂交是难以测到的，尤其是错配部分是在寡聚核苷酸的末端。在正常的杂交条件下，这两种寡聚核苷酸同A和S杂交得相当好。（2）尽管杂交本身不受错配的影响，但有连接酶催化的连接反应却非常敏感。如图A22.3所示，对于S寡聚核苷酸而言，只有缺口（nick ）的碱基按互补配对的原则同靶DNA完全配对的，才能进行连接。如果放射性的oligo将被连接到生物素标记的

19、寡聚核苷酸上，并要固体支持物上进行X射线胶片曝光的话，连接是必要的条件。8、RFLP能够用于跟踪特定染色体区域的遗传。在一定的条件下，可用靠近缺陷基因的RFLP来测定未出生胎儿是否有基因缺失。一对夫妇来进行遗传咨询，他们的第二个孩子出生后不久死于一种遗传性疾病，母亲又一次怀孕了。已夭折孩子是家系中此遗传病影响的第二例，另一例是孩子奶奶（父亲的妈妈）的一个史弟。这对夫妇想知道这次所怀的孩子是否也有这种遗传病。你已经研究过这种病的遗传性，并且知道是由常染色体的隐性基因所引起。在这种致病基因所处的染色体区内，发现整个人群中有几个限制性位点的多态性，如图226A所示，多态性位占用符号表示。你分离了双亲

20、、祖父母、以及正常孩子的DNA样品，并用限制性图谱来分析它们的特性，结果示于图226B。现在开始检测胎儿，请预测什么样的限制性酶切结果表明很可能具有遗传病？答案：8、答：只有1，2和9kb电泳带的限制性模式表明胎儿很可能具有这种遗传病。由于每个个体都是二倍体，每个基因都有两个拷贝，这就是制作这种限制性图的主要困能。最简便的做法是，初始选用证明是同型合子的个体的单个染色体作为模式。同型合子可用两种方法进行鉴定：它们由具有盯同密度的带构成的模式，总长度为12kb。按照这些标准，母亲的祖母和父亲的祖父是同型合子。他们必定是各出一条染色体给他们的子代。因此，母亲肯定有一个染色体与外祖母的染色体模式相同

21、，父亲必定有一条染色体同祖父的染色体的模式相同。对一个染色体模式的了解，使得对另一个染色体切割械式的推测度为得简单。在你已分析过的家系中，有3种不同的切割模式：模式是在位点A、B和C都是“”，产生了1，2，4和9kb的4条带。模式在位点A和C是“”，在位点B是“”，产生了1，5和6 kb3条带。模式在位点A、B是“”，但在以是“”，产生了1，2和9kb3条带。因为模式在外祖母辈中是同型合子，模式在祖父辈中是同型合子他们都不可能与遗传病有关。父亲是模式和的杂合型，而母亲是模式和的杂合型。未受影响的小孩是和型的杂合型。在这个家族生存下来的成员中仅仅没有纯合的型。另别，型也出现在祖母的DNA中，该祖

22、母的兄弟受此病的影响。综上所述，这些观察表明：型（1，2和9kb的带）很可能与这种遗传病有关。9你打算将一个具有KpnI末端的DNA片段克隆到具有BamH I末端的载体中。问题是Bam H I和Kpn I的末端是不匹配的，Bam H I是5端出端，Kpn I则是突出的3端（图227）。一位朋友建议用图227所示的寡聚核苷酸“片段”来进行连接。你并没有马上意识到这种方法是可行，因为你想到的连接作用需要邻近的5磷酸和3羟基。虽然寡聚核苷酸分子被限制性内切核酸酶切割后会产生合适的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羟基。另外，虽然图227中接头是Bam H I-Kpn I，但另一个接头却是Kpn

23、I-Bam H I，你怀疑相同的寡聚核苷酸是否能够适合这两种方式的连接。（1）画出Kpn I-Bam H II结合体和所需要的寡聚核苷酸片段的图，这种寡聚核苷酸与图227所示的是否相同？（2）画出用连接酶处理过的分子图，指明被连接的缺口。（3）你朋友的图解方法有效吗？答：9、答：（1）Kpn-BamH I的接头及它的寡聚核苷酸片段示于图A22.4A。这种接头片段可以用于两种连接，即BamH I末端和 Kpn I末端连接。（2）用DNA连接酶处理混合物得到图A22.4-B所示的重组DNA分子。如图中箭头所指，Bam H I接头中三个缺口有两个可被连接起来。这就足以将Kpn I切割的片段连接到Ba

24、mH I 切割的载体中去。（3）你朋友的方案无论是在理论上还是在实验上都很好。当DNA被转化到细胞之后，剩下的一个缺口能够被修复。应该注意到，可以用多核苷酸激酶和ATP将寡聚核苷酸的5端加上一个磷酸，经这种处理寡聚苷酸上的所有缺口都可以用连接酶进行封口。（A）Kph I- Bam H I 接头所需要的寡聚核苷酸片段，它的序列同第一个寡聚核苷酸的序列相同。（B）Bam I-Kpn I接头片段介导Kpn I切割的片段连接到BamH I切割的载体中。箭头表示可以连接的缺口。打开的环表只有经酶促修复后才能连接的缺口。划线部分是两种寡核苷酸的序列。10 YES（酵母大肠杆菌穿梭载体）是构建cDNA文库的

25、高效载体，这种载体是 噬菌体基因与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成，它兼有病毒 和质粒载体的优点。CDNA被插入载体的质粒部分，然后它能在体外被包装入病毒颗粒中，包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌。 YES中的质粒序列能够被诱导重组出 基因组，并进行独立复制，这就可以从质粒中分离出来，以便进行进一步的遗传操作。为了最大限度地提高克隆效率，载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶Xho I（5CTCGAG）进行切割，然后在dTTP存在的情况下，同DNA聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链cDNA同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头

26、连接起来，这两段寡聚核苷酸的序列是：5CGAGATTTACC和5GGTAAATC，它们的5端都是磷酸。然后将载体和cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用2ug的载体和01ug的cDNA，构建了一个有4×107个克隆的cDNA文库。问：（1）假定载体长为43kb，cDNA的平均长度是1kb，请估计在连接混合物中，载体分子同cDNA的比例是多少？（2）在此过程中，载体分子转变成重组体频率是多少（每对核苷酸的平均分子量是660Da）？（3）说明怎样处理载体和cDNA分子，才能把它们连接到一起。处理过的载体本身能自连吗？cDNA呢？（4）载体和cDNA分子要经过怎样的处理才能提高产生重组D

27、NA分子的效率？（5）能够用Xho I从重组质粒中切出cDNA吗？答：10、答：（1）在连接反应混合物中，载体分子和cDNA分子的比例大约是1：2。在长度上载体大约是cDNA的40倍（43kb:1kb），但在重量上，载体只有cDNA的20倍（2g对01g）。因此，连接混合物中，载体分子的数量只有cDNA分子的一半。（2）2g中，载体分子的数目是：4.2×1010分子数×2g4.2×1010因为这些载体分子得到了4×107的重组体，所以产生重组体的效率大约是01效率0.1（3）把Xhol切割的载体DNA与Dttp和 DNA聚合酶一起温育，使每个末端都加上一

28、个T：5CT TCGAG33GAGCT TC5这种转接体寡聚核苷酸有了可同被修饰的载体末端互补的单链尾巴：5CT CGAGATTTACC33GAGCT CTAAATGG5这样，修饰过的载体末端可以同转接头修饰的cDNA连接。修饰后的载体末端不再相互互补，因而载体本身也就不能连接在一起。对cDNA也有同样的情况。（4）载体和cDNA修饰之后，载体分子只能同cDNA分子连接，反之亦然。由于限制了载体自身的连接，从而大大提高了形成重组体分子的效率。（5）修饰的载体末端同接头分子的连接可在载体和cDNA的两个结合处重新产生 Xho I 的识别位点（CTCGAG），因此，可用Xho I从重组的质粒DNA

29、中切出cDNA。由于Xho I具有6个碱基对的识别位点，在DNA上切割的频率很低，所以大多数cDNA都可以完整地切出来。11一个癌基因，从序列上看似乎编码一个转录因子。当放在细胞中表达时，该基因的产物是完全不溶的，这阻碍了对其功能的直接检测，免疫染色表明，这种蛋白定位于细胞核内，如同推测的一样，是一种转录因子。如果能够测出它所结合的DNA序列，就可以通过现有的序列资料中查找已知基因启动子的天然位点，从而能够找到它所调节的基因。有人建议用PCR扩增同该蛋白结合的微量DNA，思路（图228）是：（1）合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PC

30、R扩增的引物位点（图228A）；（2）把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；（3）用录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；（4）用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。按照这一思路，用02ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链，经过如图228B所示的四轮选择和复制后，用BamH I和EcoR I消化分离到的DNA，将片段克隆到质粒中去，并测定了10个独立的克隆（表221）问：（1）转录因子结合的保守序列是什么？（2）结合的保守序列具有对称性吗？也就是说，具有回文结构吗？据

31、此，能否判断转录因子是以单体还是以二聚体的形式同DNA结合？（3）在02ng的样品中有多少单链的寡聚核苷酸？（一个核苷酸的平均质量是330Da）。（4）假定实验开始时所用的寡聚核苷酸混合物中，每一个中心部位的26个核苷酸组成确实是随机的，那么有滑可能所有长14bp的序列都存在于开始的样品中呢？11、答：（1）转录因子的保守结合序列是：5ATGCCCATATATGG。在表A221中，所列的序列是按照保守的结合位点排列的，有一个保守性非常好的14个核苷酸的序列，但是，两侧的保守性却相当的差。（2）保守序列中有一部分（5CCATATATG）是回文序列。在双链序列的中间两个AT碱基对之间有一个双重对称

32、性的轴。因此，这一部分的保守序列是由两个相等的“两半”即5CCATA所构成。结合位点的这种特征通常意味着它是同一个二聚体的蛋白质相结合，每一个单体识别一半序列。保守序旬中有4个碱基对不属于对称的部分，表明两个单体同DNA的相互作用的方式是不对称的。（3）在0.2ng的起始样品中，有4.8×109个寡聚核苷酸，它们的长度是76个核苷。（4）有不同的十四聚体（14mers）的总数是4142×108，而且，在起始样品中有48×109的分子。另外，每一个分子（按双链计）中央部分26个随机核苷酸中都含有26个14碱基对长度的序列。在双链的每一个方向中都有13个长为14碱基对

33、的序列。因此，在起始样品中，每一种可能的14个碱基对的序列很可能出现几百次。12打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E.coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamH I的位点，因此计划将它从BamH I的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamH I切割以后，立即用碱性磷酸酶处理，除去5磷酸。接着将处理过的载体同用BamH I切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗生基因，所以，转化的细菌能够存

34、活。实验中同时设置了4个对照：对照1：将未同任保载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上：对着2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；对着3：将经切割（但未用碱性磷酸酶处理）并且连接酶连接（但没有cDNA片段）的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；对照4：将经切割（并用碱性磷酸酶处理过）并用DNA连接酶连接（但没有cDNA片段）的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平反上都长出了多到无法计数的菌落（表222）。在第二次实验中，自己备制感受细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长（表222）。接着又进行了第三次实验，这次得到

35、了转化子（表222）。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamH I进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。（1）你如何看待第一次的实验结果？对照1的目的是什么？（2）影响第二次实验结果的原因是什么？对照2的作用何在？（3）对照3和4各有什么作用？（4）为什么要用碱性磷酸酶处理载体？表222 cDNA克隆的结果实验结果制备的样品123对照1只有细胞TMTC00对照2未切的载体TMTC01000对照3省去磷酸酶处理，无cDNATMTC0435对照4无cDNATMTC025实验样品TMTC034答：（1）如果仅是细

36、胞本身就能产生菌落，意味着发生了某种错误，这有几种可能性。首先是错误地选用了带有克隆载体并具有抗生素抗性的细胞制备感受态；或是感受态细胞已经污染上了具有抗生素抗性细胞。最后一种可能性是忘记了在平板中添加抗生素，或是抗生素的量加得不够。（2）如果用未切割的载体转化细胞得不到菌落，也是由于某种错误所致。这也有几种可能性。其一是感受态细胞制备得不合适，因而不能摄取DNA；其二是平板中抗生素太多；其三可能是平板制备科不正确，不能支持细菌的生长。因此，对照2如同对照1一样，确认细胞和平板都能像预期的那样，能够很好地工作。（3）对照3是检查切割载体的末端是否同预期的一样，以及连接酶是否具有活性。限制性内切

37、核酸的制备物（或是所用的缓冲液）偶而会污染上外切核酸酶，这就会修饰末端，使得不能够连接。或者，缓冲液的成分不合适，这也会妨碍连接酶的作用。（4）用碱性磷酸酶处理载体，以除去5磷酸，可防止载体自身连接。载体的重新连接，可以产生很高的带有载体而没有插入物的菌落本底。因为cDNA没有用磷酸酶处理，它保留有5磷酸，因而cDNA仍能同载体连接。因此，采用磷酸酶处理载体，以降低仅有载体的菌落数，增加携带重组克隆的比例。13打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结

38、合，便很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。图229是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对PCR引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。答：图A225显示了在蛋白质的N端或C端添加的6个组氨酸的成对PCR引物。在两种情况中，左边的引物是同DNA的下面一条链互补的（没有标出），引发了向右方向的合成。右边的引物是同DNA的上面的一条链互补，并引发向右方向的合成。14从E.coli中分离到一种hemA突变体，这种突变是不可恢复的，并且需要生长在琥珀酸的平板上才能利用 氨基乙酰丙酸合成血红素。希望得用该突变体去克隆E.coli的hemA基因。首先用Sau3A部分酶切E.coli的DNA，得到的DNA片段平均普2kb,然后将这些片段从BamH I位点克隆到质粒pBR322中，连拉后转化hemA突变体。根据氨苄青霉素抗性来选择重组体