高级技能训练分子生物学实验技术

1、分子生物学实验指导江南大学食品营养与功能因子研究中心2009年09月目 录实验一 总RNA的提取和纯化1实验二 RNA的甲醛变性电泳3实验三 RTPCR5实验四 PCR基因扩增7实验五 琼脂糖凝胶电泳检测DNA9实验一 总RNA的提取和纯化【实验目的】每一个真核细胞约含10-5g RNA。理论上每克细胞可分离出5-10mgRNA，其中80-85%是rRNA（主要是28S、18S和5SrRNA），10-15%tRNA和核内小分子RNA，以及1-5%的mRNA。mRNA是一类分子量不均一的RNA，是分子生物学的主要研究对象之一。提取高纯度完整的RNA，是研究基因表达、体外转录、构建cDNA文库、R

2、T-PCR、Northern杂交的重要基础环节。大多数真核细胞mRNA的3´末端有polyA组成的尾，利用此特性，可以方便地用寡聚（dT）亲和层析柱分离mRNA。本实验按照TRIzol法提取总RNA。可用于人、动植物、微生物总RNA的提取分离。TRIzol中含有RNase抑制剂异硫氰酸胍、-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠，可有效的抑制RNA降解，保持RNA的完整性；同时，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白分离，在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无蛋白和DNA的水相中，容易被异丙醇沉淀。氯仿不但有一定的蛋白质变性作用，而且能迅速使各相分离，使DNA

3、与其它成分分开。异丙醇使RNA沉淀浓缩。1. 4取100 mg新鲜肝组织加1 ml TRizol（预冷）试剂，于冰浴中匀浆，后将匀浆液转移至1.5 ml 离心管中，冰浴10 min；2. 加入200l（或1/ 5体积）的氯仿，剧烈振荡混合30 s， 12000 rpm 离心 15 min。离心管中液体分为3层：上层为水相，RNA在此相中，蛋白质在下层黄色的有机相中，DNA保留在上下两层的界面处的中间层中；3. 小心吸取上层水相约0.4ml 于新的塑料离心管中（切勿吸取中间层和下层液体）。加根据RNA提取量加约100 DEPC处理的水溶解沉淀，65水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA

4、溶液。如须保存，可加0.1体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.2倍体积的冰无水乙醇，充分混匀，于-70低温保存。或用稳定的甲酰胺溶解（4mg/ml）, -20保存，用时，4倍乙醇沉淀，回收RNA。RNA纯度、浓度测定及分子完整性的鉴定 RNA是否能用于后续实验，取决于它的纯度和分子的完整性，常用的鉴定方法是测定样品260 nm与280 nm的光吸收值以及电泳显示RNA分子是否降解。1. 260 nm /280 nm光吸收比值取10µL 总RNA样品，加1000µL DEPC处理过的水，混匀，测同一样品在260nm和280nm光吸收值，以A260 / A280 的比值表示其

5、纯度，比值在之间为纯的RNA，比值低于1.8，说明RNA样品有蛋白质或酚的污染，需要用氯仿重新抽提。2. RNA含量 RNA浓度（/ml ）= A260×40×（1/光径）×稀释倍数 RNA得量（）=RNA浓度×最终RNA原液毫升数 RNA浓度约1-5µg/µL为宜3. 电泳鉴定（见实验二）RNA样品（约5-10）经含甲醛的1.5 % 琼脂糖凝胶变性电泳，电泳后在紫外光激发下，RNA分子会产生桔红色荧光，如此可以观察到28 S和18 S rRNA两条带是否清晰，若28 S的荧光强度为18 S的二倍以上，则说明RNA分子没有降解。【注意

6、事项】创造一个无RNase的环境，尽量减少外源RNase及组织细胞内源RNase对RNA的降解作用。1. 实验器具的预处理和配制试剂的注意点（1）金属、玻璃器皿：通常的高压消毒方法不能充分使RNase失活，必须将清洗烘干的玻璃器皿等，用铝铂包装好，（15磅）高温高压20 min后，烘干使用；DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。DEPC水经处理，可分解为CO2而无害。（3）所有试剂、器具应新包装并专用。（4）实验室环境洁净，避免飞尘及携带微生物RNase污染

7、；为防止操做者手上、唾液的RNase对样品和试剂污染，实验中要戴一次性手套和一次性口罩，并经常更换手套；2. 特异性RNase抑制剂的应用（1）氧钒酰核苷复合物（Vanadyl-ribonuCleoside Complexes，VRC）它是一种由氧化钒离子和四种核苷（腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷）组成的复合物，可与RNase结合而抑制RNase的活性。常用浓度为10 m mol；（2）RNasin：为RNase的非竞争、特异抑制剂，1mmol/L二巯基乙醇益于其发挥最大抑制活性。反复冻融易破坏其活性。样品中的VRC和RNasin都可用酚抽提方法去除。3. 组织块用液氮研磨，效果最好；若没有液氮或电动

8、匀浆器，可用手动匀浆器代替，   此时组织块需先用眼科剪将组织绞碎，然后再充分研磨。高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨 后须4 12000离心10min去掉不溶物，再进行后面操作。核酸是两性解离物质，一般在pH 8.0时向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由电泳时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开，因此，用适当浓度的凝胶（主要是琼脂糖凝胶和聚丙酰胺凝胶）介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的。影响核酸分子迁移率的因素主

9、要有核酸分子量大小、电荷密度、颗粒形状、空间构型、胶浓度、电场强度以及缓冲液离子强度等。一般核酸分子量和形状愈小、电荷密度愈大、胶浓度愈低、电场强度和缓冲液离子强度愈强，则迁移率液愈大。甲醛作为变性剂，与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定sehiff碱基对，在凝胶中可阻止链内碱基配对，使RNA维持在变性状态，sehiff碱基对不稳定易被稀释除去。核酸凝胶电泳结果的检测方法有EB（溴化乙锭）、银染法及同位素放射自显影等，其中最常用是EB染色法。EB是一种荧光染料，可嵌入核酸的配对碱基中，在紫外下发出荧光。RNA分子中常用存在自身碱基配对的双链区，也可嵌入EB分子。1. 200g/ml电泳槽的处理

10、用去污剂洗涤电泳槽，再用水冲净，用无水乙醇漂洗、干燥，然后在3 H2O2中浸泡30 min,弃3H2O2，用0.1%DEPC处理水将其彻底冲洗干净；2. 胶版制作取一干净的胶板，用胶带纸将胶板两端封住，放于平台上，插入梳子；3. 样品制备4. 2l10×mops3l甲醛溶液，变性冰中冷却，（RNA含量约5-10g）电泳结束，将胶置于UVP凝胶成像系统中观察、摄像（或在紫外观察箱中下照像）【注意事项】1. 甲醛有毒，最好在通风橱中操作；2. 琼脂糖要完全熔于水中，凝胶不能有气泡存在；3. 电泳胶中含溴化乙啶，最好经处理后丢弃。逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcript

11、ion-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、常用反转录酶：1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱，最适作用温度为37。 2 禽成髓细胞瘤病毒（A

12、MV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性，最适作用温度为42。 3MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScript。此种酶较其它酶能将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、常用合成cDNA引物：1 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。 2 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与m

13、RNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。（一） （一）试剂RNA提取试剂、第一链cDNA合成试剂盒dNTP、Taq DNA聚合酶1.合成cDNA在PCR管中加25反应体系：第一步：模板RNA（约2g） 2ldNTP（10mmol/L） 2lOligo(dT) 2lDEPC水 4l70 5min然后至冰浴迅速冷却；第二步：5×逆转录缓冲液 5lRnase Inhibitor 0.2lM-MLV逆转录酶（200U） 0.5DEPC水 9.3l37 水浴1.5 h, 95 3min, -20保存2PCR：（1）取PCR管配制25l体系，依次加入下列试剂： 第一链cDNA 2 l 上游引物（10 pM） 1l 下游引物（10 pM） 1l dNTP （10 mmol/L） 0.5l 10×PCR buffer 2.5l Taq 酶（4 u/L） 0.2lMgCl2 1.5l ddH2O 16.3l轻轻混匀，离心；（2） PCR扩增反应条件为：（3） 电泳鉴定：琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。实验四 PCR基因扩增【实验目的】通过本实验学习PCR反