实验一细胞培养技术1

1、实验一实验一 细胞培养技术细胞培养技术一、定义一、定义细胞培养（细胞培养（cell culture）是指将动物组织或细胞分）是指将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境下使其继散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境下使其继续生长增殖的过程。续生长增殖的过程。一般体外培养的细胞不会发生分化成为组织，在体一般体外培养的细胞不会发生分化成为组织，在体外培养的条件下可以观察细胞生命活动规律，此外外培养的条件下可以观察细胞生命活动规律，此外收获细胞本身的同时也可以收获细胞的产物。收获细胞本身的同时也可以收获细胞的产物。1、美国生物学家哈里森于、美国生物学家哈里森于1907年采用盖片覆盖凹窝玻

2、璃悬滴培年采用盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周，开创了养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周，开创了细胞培养。细胞培养。2、1923年，卡瑞尔发明了卡士瓶培养法，扩大了培养组织的生年，卡瑞尔发明了卡士瓶培养法，扩大了培养组织的生存空间。存空间。3、1951年，厄尔利开发了动物细胞体外培养的培养基，动物细年，厄尔利开发了动物细胞体外培养的培养基，动物细胞培养技术开始形成。胞培养技术开始形成。4、20世纪世纪70年代，大规模微生物培养技术的出现，几乎代替了年代，大规模微生物培养技术的出现，几乎代替了动物的细胞培养，但在生产过程中，出现了许多生物活性蛋白动

3、物的细胞培养，但在生产过程中，出现了许多生物活性蛋白质只能在动物细胞中产生，因为原核细胞缺乏蛋白质转录后修质只能在动物细胞中产生，因为原核细胞缺乏蛋白质转录后修饰能力，也不能将蛋白质产物自动分泌到细胞外。饰能力，也不能将蛋白质产物自动分泌到细胞外。5、20世纪世纪80年代：基因工程技术和细胞融合技术迅速发展，能年代：基因工程技术和细胞融合技术迅速发展，能把特定的外源基因转染到动物细胞体内，使其得到高质量的表把特定的外源基因转染到动物细胞体内，使其得到高质量的表达。达。二、发展的历史二、发展的历史包括病毒疫苗，非抗体免疫调节剂，多肽生包括病毒疫苗，非抗体免疫调节剂，多肽生长因子，酶类，激素，肿瘤

4、特异性抗原，单长因子，酶类，激素，肿瘤特异性抗原，单克隆抗体，病毒杀虫剂等。克隆抗体，病毒杀虫剂等。三、动物细胞生产的生物制品三、动物细胞生产的生物制品1.培养细胞的生长方式培养细胞的生长方式贴附生长：贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。体瘤细胞。悬浮生长：悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。四、培养细胞的生长特性四、培养细胞的生长特性2.每代贴附生长细胞的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程游离期游离期贴壁期贴

5、壁期潜伏期潜伏期对数期对数期平台期平台期衰退期衰退期2.每代贴附生长细胞的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。一般维持悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。一般维持10分钟至分钟至4小时。小时。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在平均在10分钟至分钟至4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。料、其它细胞等。潜伏期：贴壁后并不马上分裂而是有一个潜伏期，潜伏期：贴壁后并不马上分裂而是有

6、一个潜伏期，该期长短与接种量、细胞种类有关，一般为该期长短与接种量、细胞种类有关，一般为6至至24小小时。时。2.每代贴附生长细胞的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程对数生长期：细胞分裂旺盛，可持续对数生长期：细胞分裂旺盛，可持续35天，天，细胞接触汇合成片，肿瘤细胞或转化细胞可发生细胞接触汇合成片，肿瘤细胞或转化细胞可发生细胞堆积，正常细胞无此现象。细胞堆积，正常细胞无此现象。稳定期（平台期）：细胞达一定数量后，由于稳定期（平台期）：细胞达一定数量后，由于培养空间与营养物质有限，特别是代谢废物积累培养空间与营养物质有限，特别是代谢废物积累的不利条件下，细胞进入新生的细胞数等于死亡的不利条件下

7、，细胞进入新生的细胞数等于死亡细胞数的动态平衡时间。细胞数的动态平衡时间。衰亡期：营养物的耗尽和有害物质的作用，细衰亡期：营养物的耗尽和有害物质的作用，细胞进入衰亡期，活细胞减少，死细胞增多。胞进入衰亡期，活细胞减少，死细胞增多。3.细胞的生长条件细胞的生长条件恒定的温度：恒定的温度：37，5%CO2培养箱培养箱恒定的湿度恒定的湿度:培养箱中有水盘培养箱中有水盘等渗环境：培养液提供等渗环境：培养液提供营养物质：培养液提供营养物质：培养液提供无污染：包括微生物的污染和杂质的污染无污染：包括微生物的污染和杂质的污染 要求使用纯水，并对所有和细胞接触的物品都要清洗要求使用纯水，并对所有和细胞接触的物

8、品都要清洗干净并灭菌，培养液中还要加入青链霉素，操作在无干净并灭菌，培养液中还要加入青链霉素，操作在无菌环境下进行菌环境下进行培养用器皿：培养皿，培养瓶等培养用器皿：培养皿，培养瓶等气体：培养器皿并非完全密闭的，细菌不能通过，气气体：培养器皿并非完全密闭的，细菌不能通过，气体可以体可以尽量恒定的尽量恒定的pH值：值：NaHCO3与与CO2形成缓冲对。形成缓冲对。5% CO2 。各种操作液：如胰酶，各种操作液：如胰酶，EDTA，PBS等。等。此外还要对细胞状态进行观察和监测（倒置显微镜）。此外还要对细胞状态进行观察和监测（倒置显微镜）。五、实验准备工作五、实验准备工作1.实验器具及设备：实验器具

9、及设备：v超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸器，酸缸vCO2培养箱培养箱v倒置显微镜倒置显微镜v液氮罐液氮罐v自动双重纯水蒸馏器，纯水仪自动双重纯水蒸馏器，纯水仪v耗材：细胞培养瓶，细胞培养板，细胞冻存管耗材：细胞培养瓶，细胞培养板，细胞冻存管超净工作台超净工作台超净工作台的工作原理超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒和细菌，中的尘埃颗粒和细菌，使空气得到净化。净化使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环使工作台内构成

10、无菌环境。境。 压力蒸汽消毒器压力蒸汽消毒器高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅湿热消毒，用途广。湿热消毒，用途广。电热干燥箱电热干燥箱干热消毒干热消毒180 ，作用作用2小时至小时至4小小时。主要用于玻时。主要用于玻璃器皿的消毒璃器皿的消毒 。滤器及滤膜滤器及滤膜过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌血清、酶液等均采用滤过法除菌 。CO2培养箱培养箱CO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37，5CO2。使用。使用CO2培养箱培养细胞时应培养箱培养细胞时应注意的问题：注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶用螺旋口瓶培养

11、细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消保持培养箱内空气干净。定期消毒。毒。箱内蒸馏水槽中应放置灭菌蒸馏箱内蒸馏水槽中应放置灭菌蒸馏水水3000毫升以保持箱内湿度，避免毫升以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。培养液蒸发。倒置显微镜倒置显微镜液氮罐液氮罐自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器 纯水仪纯水仪细胞培养板细胞培养板细胞培养瓶细胞培养瓶离心管离心管冻存管冻存管2.常用器皿清洗常用器皿清洗v玻璃器皿用玻璃器皿用自来水浸泡、洗涤剂刷洗、烘干、自来水浸泡、洗涤剂刷洗、烘干、浸浸酸酸（24小时）。小时）。v流动的流动的自来水洗自来水洗10遍，蒸溜水遍，蒸溜水冲

12、洗冲洗3次，三次，三蒸水或纯净水洗蒸水或纯净水洗1次，次，180干热灭菌干热灭菌4h-6h。v塑料及橡胶制品等，超声波清洗塑料及橡胶制品等，超声波清洗3次，次，121高压湿热灭菌高压湿热灭菌15min,烘干备用。烘干备用。3.细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制水：新鲜的三蒸水或去离子水水：新鲜的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 ml消化液消化液v胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精

13、氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。而使细胞分离。 v胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。度会损伤细胞。v胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25。用滤器过滤除菌。用滤器过滤除菌。v胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。分钟。v用含血清培养液可以终止其对细胞的消化作用。用含血清培养液可以终止其对细胞的消化作用。培养基培养

14、基A. 天然培养基天然培养基v天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。和牛胚浸液）。v优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好v缺点：来源受限。缺点：来源受限。v成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。的分析。v易发生支原体污染。易发生支原体污染。 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。液，分天然培养基和合成培养基。B. 合成培养基合成培养基v合成培养基是根据细胞生存所需物质的种

15、类和数量，合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DF12等。等。v合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。物、无机盐和其它一些辅助物质。v优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。 v缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。需要。 v在培养液配制后，培养液内常

16、加适量抗菌素，以抑在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。制可能存在的细菌的生长。v青霉素抑制细菌的细胞壁合成。青霉素抑制细菌的细胞壁合成。v链霉素抑制细菌蛋白质的合成。链霉素抑制细菌蛋白质的合成。v通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。单位。抗菌素的使用抗菌素的使用六、细胞的培养方法六、细胞的培养方法v主要包括两种主要包括两种 1.原代培养：将机体取出的组织或细胞进行初次原代培养：将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。培养的过程。 2.传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养。传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养。贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法1.弃掉弃掉培养瓶中的培养液培养瓶中的培养液。2.加入加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置瓶底为准），静置2-10min（显微镜下动态监测）。（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞