【课件】第1章第2节微生物的培养技术及应用（第2课时）（人教版2019选择性必修3）

1、 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。更难实现。稀释涂布平板稀释涂布平板法法呈呈现的杂菌群现的杂菌群选择性必修选择性必修3 3第第1 1章第章第2 2节微节微生物的培养与应用生物的培养与应用第第2 2课时课时 微生物的微生物的选择选择培养培养和计数和计数1 1. . 阐明微生物选择培养的原理。阐明微生物选择培养的原理。2 2. . 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。进行土壤中

2、分解尿素的细菌的分离和计数。寻找耐高温的寻找耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶启示启示：寻找目的菌种时要根据它对：寻找目的菌种时要根据它对生存环境生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原因筛选原因：因为热泉的：因为热泉的高温高温条件条件淘汰淘汰了绝大多数微生物，使耐热的了绝大多数微生物，使耐热的TaqTaq细菌细菌保留保留下来。下来。PCRPCR是一种在体外是一种在体外DNADNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。19661966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中

3、发现了耐热的年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的TaqTaq细细菌，并分离到耐高温的菌，并分离到耐高温的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）。酶）。一、选一、选择培养基择培养基耐高温的酶耐高温的酶耐高温生物体耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）高温环境（热泉、火山口）寻找寻找寻找寻找培养基中加培养基中加氨苄青霉素氨苄青霉素具有具有氨氨苄青霉苄青霉素抗性素抗性的菌落的菌落没有没有氨氨苄青霉苄青霉素抗性素抗性的的细菌细菌培养基应培养基应有菌落有菌落没有没有氨苄青霉素抗氨苄青霉素抗性性的的细菌细菌被淘汰被淘汰怎样怎样选择选择出出抗氨苄青霉素能力抗氨苄青霉素能力的细菌的细菌?

4、?2.2.例：例：一、选一、选择培养基择培养基3.3.实验室中微生物的筛选原理：实验室中微生物的筛选原理：人为提供人为提供有利于目的菌株有利于目的菌株生长的条件生长的条件( (包括营养、温度、包括营养、温度、pHpH等等) )，同，同时时抑制或阻止其他微生物抑制或阻止其他微生物生长。生长。一、选一、选择培养基择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，培养基，叫做叫做选择培养基选择培养基。4.4.选择培养基举例选择培养基举例不加有机碳源不加有机碳源自养微生物自养微生物不加氮源不加氮源固氮微生物固氮微生物

5、加入青霉素加入青霉素酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌( (青霉素能杀死细菌、放线菌青霉素能杀死细菌、放线菌) )加高浓度食盐加高浓度食盐金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌石油是唯一碳源石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物能消除石油污染的微生物选择培养基配方的设计选择培养基配方的设计 尿素尿素CO(NH2)2CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤施入土壤后，会后，会被土壤中被土壤中的的某些细菌分解成某些细菌分解成NH3NH3，再被转化为，再被转化为NO3-NO3-、NH4+NH4+等被植物吸收等被植物吸收

6、。而这些细菌之所以能分。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生解产生NH3NH3，NH3NH3可以作为细菌生长的氮源。可以作为细菌生长的氮源。讨论：讨论：1.1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？在选择培养基中，在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖育繁殖2.2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不

7、同点？该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同一、选一、选择培养基择培养基二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养1.1.方法：方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法2.2.操作流程操作流程铲取土样，将铲取土样，将样品装入纸袋中样品装入纸袋中将将10g10g土样加入盛有土样加入盛有90mL90mL无无菌水菌水的锥形瓶中，充分的锥形瓶中，充分摇匀摇匀，制成制成菌液菌液。取取1mL1mL上清液加入上清液加入盛有盛有9mL9mL无菌水无菌水的试管中，的试管中，依依次等比

8、稀释次等比稀释。1101107 71101105 51101106 61101103 31101102 21101104 49mL9mL无菌水无菌水11011090mL90mL无菌水无菌水1m1mL L1m1mL L1m1mL L1m1mL L1m1mL L1m1mL L取取0 0. .1mL1mL菌液，菌液，滴加到（选择）滴加到（选择）培养基培养基表面表面。将涂布器将涂布器浸在浸在盛有盛有酒精酒精的烧杯中。的烧杯中。将涂布器放在将涂布器放在火焰上灼火焰上灼烧烧，待酒精，待酒精燃尽燃尽、涂布器、涂布器冷却冷却后，再进行涂布后，再进行涂布用用涂布器涂布器将菌液将菌液均匀均匀地地涂布涂布在培养基表

9、面。涂布时在培养基表面。涂布时可转动可转动培养皿培养皿，使涂布均匀。，使涂布均匀。3.3.注意事项：注意事项：10g10g土样土样加入盛加入盛有有90mL90mL无菌水中后，无菌水中后，已稀释已稀释1010倍倍，在计算时，不要忽略；，在计算时，不要忽略；由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要，所以还需要进一步验证；进一步验证；过程中所有操作都应在过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁进行；进行

10、；将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。酒精。二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养4.4.培养观察：培养观察： 放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养1 12d2d三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定间接计数法间接计数法1.1.稀释涂布平板法稀释涂布平板法（1 1）原理：原理： 当样品的稀释度足够当样品的稀释度足够_时，时，培养基表面生长的一个培养基表面生长的一个_，来源于，

11、来源于_中的一个中的一个_；通过计数平；通过计数平板上的板上的_数，就能推测出样品中大约数，就能推测出样品中大约含有多少含有多少_；高高菌落菌落样品稀释液样品稀释液活菌活菌菌落菌落活菌活菌（2 2）计数原则计数原则选择菌落数为选择菌落数为_的平板计数的平板计数30-30030-300同一同一稀释度下，应稀释度下，应至少至少对对_个平板进行重复计数，然后求出个平板进行重复计数，然后求出_；3 3平均值平均值样品的样品的_将直接影响平板上的菌落数目；将直接影响平板上的菌落数目；稀释度稀释度（3 3）结果分析结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目统计的菌落数往往比活菌的实际数目_； 原因：原因：

12、_ _ _统计结果一般用统计结果一般用_而不是用活菌数来表示；而不是用活菌数来表示；少少当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落是一个菌落菌落数菌落数（4 4）计算公式：计算公式：每每g g样品中的菌落数样品中的菌落数(C(CV)V)M MC C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)(mL)M M代表稀释倍数代表稀释倍数三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定2 2. .显微镜直接计数显微镜直接计数直接计数法直接计数法（1

13、 1）方法方法： 利用特定的利用特定的_或或_在在_下观察、下观察、计数，然后再计算计数，然后再计算_的样品中微生物的数量；的样品中微生物的数量；细菌计数板细菌计数板血细胞计数板血细胞计数板显微镜显微镜一定体积一定体积血细胞计数板常用于血细胞计数板常用于_等的计数等的计数相相对对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子较大的酵母菌细胞、霉菌孢子细菌计数板可对细菌计数板可对_进行观察和计数；进行观察和计数；细菌等较小的细胞细菌等较小的细胞（2 2）优点：）优点：快速直观快速直观（3 3）缺点：）缺点：统计统计的的结果一般是活菌数和死菌数的总和结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌不能区分死菌与活菌与活菌

14、。个体小的细菌个体小的细菌在显微镜下在显微镜下难以观察难以观察。三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定四、土四、土壤中分解尿素的细菌的分离与记数壤中分解尿素的细菌的分离与记数1.1.土壤取样土壤取样2.2.制备培养基制备培养基3.3.样品稀释、取样涂布样品稀释、取样涂布4 4. .微生物的培养、观察并记录结果微生物的培养、观察并记录结果5 5. .细菌的计数细菌的计数1.1.土壤取样土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。先准备好的信封中。2.2.制备培养基制备培养基

15、牛肉膏蛋白胨培养基作为牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，对照，判断选择培养基是否起到选择作用。判断选择培养基是否起到选择作用。选用稀释倍数为选用稀释倍数为10103 310107 7的稀释液。每个稀释度下需要的稀释液。每个稀释度下需要3 3个选择培养基（平行个选择培养基（平行重复原则），重复原则），1 1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备制备5 5个牛肉膏蛋白胨培养基个牛肉膏蛋白胨培养基和和1515个选择培养基，个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。准备好无菌试管和移液管。3.3.样品稀释、取样涂布样品稀释、取样涂布测定土壤细菌数量，一般选用测定土壤细菌数量，一般选用101

16、04 4、10105 5和和10106 6倍的稀释液进行平板培养；测定倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用放线菌的数量，一般选用10103 3、10104 4和和10105 5倍稀释液；测定真菌的数量，一般选倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用用10102 2、10103 3和和10104 4倍稀释液。倍稀释液。因为土壤中各类微生物的因为土壤中各类微生物的数量是不同的，数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要为获得不同类型的微生物，就需要按按不同的稀释度不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。将将10g10

17、g土样加入盛有土样加入盛有90mL90mL无菌生理盐水的锥形瓶中无菌生理盐水的锥形瓶中, ,充分摇匀，吸取上清液充分摇匀，吸取上清液1mL1mL，转移至盛有，转移至盛有9mL9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至水的无菌试管中，依次等比稀释至10107 7稀释度，并按照稀释度，并按照由由10107 7至至10103 3稀释度的顺序分别吸取稀释度的顺序分别吸取0.1mL0.1mL进行进行平板涂布操作平板涂布操作。按照浓度从。按照浓度从低低到高的顺序涂布平板到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。，不必更换移液管。注意：注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽由于初次实验，对于稀

18、释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。四、土四、土壤中分解尿素的细菌的分离与记数壤中分解尿素的细菌的分离与记数4 4. .微生物的培养、观察并记录结果微生物的培养、观察并记录结果将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在3030下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。中菌落的数量、形态等，并做好记录。不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌细菌一一般在般在30373037的温度下培养的温度下培养

19、12d12d；放线菌放线菌一般在一般在25282528的温度下培的温度下培养养57d57d；而；而霉菌霉菌一般在一般在25282528的温度下培养的温度下培养34d34d。一般来说，在一定的培养条件下一般来说，在一定的培养条件下( (相同的培养基、温度及培养时间相同的培养基、温度及培养时间) )，同，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。形状、大小、隆起程度和颜色。5.细菌的计数细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在当菌落数目稳定时，选取菌落数在3030030300的的平板进行计数。在同一稀释度平板进行计数。在同一稀释度下，至少

20、对下，至少对3 3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。的稀释度计算出样品中细菌的数目。( (一一) )无菌操作无菌操作1.1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2.2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞塞。3.3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。( (二）做好标记二）做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。（三）规划时间（三）规划时间三、操作提示三、操作提示四、土四、土壤中分解尿素的细菌的分离与记数壤中分解尿素的细菌的分离与记数微生物的微生物的选择选择培养培养和计数和计数1 1（20212