共聚焦课件2010

1、兰州大学医学实验中心兰州大学医学实验中心 近年来, 激光共聚焦显微镜在医学和生物学研究方面的应用越来越广泛，它成像清晰、精确、客观，大有淘汰普通光学显微镜和荧光显微镜的趋势。因此，作为医学工作者，了解和应用这种仪器亦是大势所趋。显微镜成像清晰度的决定因素显微镜成像清晰度的决定因素: : 1. 1.分辨率分辨率2. 2.球差球差3.3.色差色差1 1、分辨率、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。0.25 m25 mm2 2、球差：、球差： 是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时

2、不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。3、色差： 是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。共聚焦显微镜的原理简介共聚焦显微镜的原理简介（ ）原理简介原理简介激光源 共聚焦显微镜 步近器 检测器 光电倍增管 计算机 图象输出设备（显示器 彩色打印机）。软件：软件： 显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统激光器光电倍增管检测器显微镜步近器计算机电子图像软件光源光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。2 2、采用了共扼聚焦技术

3、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别Z 通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象精细图象，将一个连续的光切图象Z Z轴重叠就可形成轴重叠就可形成一个完整的三维图象一个完整的三维图象牛肺动脉内皮细胞 ，微管牛肺动脉内皮细胞 ，微管鼠成纤维细

4、胞单克隆anti-tubulin标记 检测人类癌细胞表皮生长因子涡虫纲扁虫肌动蛋白丝鬼笔环肽培养的293细胞绿色荧光蛋白培养的人肝癌细胞哑叮橙染色随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值获得数据的TXT文件将TXT文件导入EXCEL进行统计分析入射光被检测层面整个样品白光（不能透过）发射光 较厚层面 较薄层面人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 较厚层面 （平滑肌损伤可见） 较薄层面兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。加药加药峰值峰值所选细胞所选细胞胞浆胞浆胞核胞核胞浆胞核同时测胞浆胞核同时测量量绿色：SYBR 14染色，活精子红色：PI染色，死精子牛精子绿色：MitoTracker Green 紫色：Hoechst 33342 Mouse 3T3 cells 红色：ethidium homodimer1 ，染核绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白牛肺动脉内皮细胞蓝色：Hoechst 33342 染DNA红色：PI，染核仁RNA绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白藤黄微球菌绿色：活菌红色：死菌染色：LIVE/DEAD BacLight