第05章 纸层析

1、生物活性分子的分离与表征第3章、沉淀法第4章、吸附层析第5章、纸层析第6章、凝胶过滤层析第7章、离子交换层析第8章、亲和层析第9章、疏水层析第第5章章 纸层析纸层析Paper Chromatography5.1、纸层析简介5.2、基本原理5.3、实验操作技术5.1、纸层析简介纸层析与近年发展起来的亲和层析、等电聚焦、等速电泳、聚丙烯酞胺凝胶电泳等方法比较，相对来说是一种“古老”的方法。由于具有操作简便，不需特殊仪器设备，消耗样品量少等特点，囚此在生物化学、药物学、医学检验和医药工业等学科仍有应用。适用于分离氨基酸、核苷酸、有机酸、糖、维生素、抗菌素等小分子物质。5.2、基本原理纸层析是最简单的

2、液-液相分配层析。纸及其饱和水为层析的固定相，.与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。 一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况可以用分配系数来表示:如果有多种物质存在于固定相和流动相之间，它们将随着流动相的移动在固定相与流动相之间进行连续地、动态地不断分配，由于各种物质分配系数的差异，其移动速度不同。分配系数大的组分在纸上迁移速度慢；分配系数小的组分迁移速度快。5.3 实验操作技术一、滤纸的选择层析用的滤纸必须质地均匀，厚薄一致，具有一定的机械强度和一定的纯净度。适用于纸层析的滤纸种类较多，常用的国外生产的滤纸如Whatman No.l - No.4等， Whatman No.3是一种厚

3、滤纸，适于分离的样品量较多。国产新华1号滤纸.与Whatman No.l滤纸性质相似，新华3号也是厚滤纸。二、溶剂的选择能否选择一种合适的溶剂系统进行展层是层析成败的关键。选择溶剂系统的原则:1、通常选用与水部分混溶的有机溶剂或能与水相混溶的其他溶剂为展层剂。2,展层剂通常选用二元溶剂系统。3,组成多元溶剂系统的各组分之间以及各组分和待分离物之间不起化学反应。4、挥发性太大的溶液不宜作溶剂。5、被分离物质各组分的Rf值在所选用的溶剂中应在0.05-0.90之间，各组分不应集中在滤纸的某一区域而应分布全面。6,溶剂的规格应用色谱纯或分析纯，必要时经重蒸馏处理。三、样品的预处理试样中一些杂质的存在

4、会严重影响分离效果。在糖类和氨基酸的纸层析中，常见的干扰因素是样品中含有高浓度的金属离子，如Cu2+、Fe2+、Ag+和Al3+等。层析前样品必须作脱盐处理，脱盐的方法可用透析、凝胶过滤和离子交换法等。四、点样常用毛细管或微量注射器吸取一定量样品溶液点在滤纸上，样品点的位置距纸一端2-3 cm，样品点彼此间的距离为2-2.5 cm。加样量的多少由分离的样品、展层方式和检出方法来决定，对于单向上行和下行层析来说，点样体积在2一20l之间，样品量在10-30 g之间即可得到好的层析图。样品一般点成圆形或条状。直径不要超过0.5 cm。五、饱和与展层点样后的滤纸悬挂或站立在层析箱(缸)中。如使用有机

5、溶剂一与水不完全混溶的展层剂时，将水相盛于小烧杯内进行饱和。 如使用有机溶剂能与水完全混溶的，直接用展层剂进行饱和，使层析箱中的大气和滤纸为水相蒸汽所饱和，直至达到平衡，饱和时间一般为4-5小时。双向纸层析是层析法的一个改进，层析时样品点在左下角，用溶剂A进行第一向展开。从洛剂中取出层析图谱后使之干燥，然后旋转90度再用溶剂B进行第二向展层。此方法己应用于研究酶的专一性，即在两次展开之间把酶溶液喷淋到层析图谱上，然后观察该酶对第一次分离的化合物作用。展层时要防止滤纸与滤纸、滤纸与容器壁贴在一起以及滤纸的歪斜与弯曲。为防止操作中对滤纸的污染，尽量避免用手直接接触滤纸，最好带手套或指套。展层时间根

6、据温度和纸的大小、性质而定，一般是待溶剂前沿距离滤纸另一端1 cm处停止。六、图谱显示展层之后从层析箱中取出滤纸并记下溶剂前沿，放在鼓风烘箱中干燥或用热风吹干。然后选择适当方法将无色物质.显示出来。 显示图谱的方法有: 化学方法 物理方法 微生物法 同位素和放射自显影法微生物法是基于对某些微生物的生长抑制作用来决定是否存在有关化合物的一种检出方法。方法:将展层后的滤纸烘千，平贴在接种有某种试验菌的琼脂平板的表面，37保温15-20小时后，在有抗菌素扩散进琼脂平板的部位，即明显可见无微生物的抑菌圈。根据抑菌圈的直径大小与抗菌素浓度的关系可半定量检出抗菌素含量。同位素和放射自显影方法层析分离后，纸

7、上的色谱点可用放射性试剂处理，使其形成一种具有放射性的衍生物，然后再用放射自显影方法将它们定位。方法:取一张大小相当的感光胶片，在暗室内与滤纸重合在一起，并用一平板均匀压好，即开始“曝光”，时间长短由滤纸上放射性同位素强度决定，然后将胶片经显影、定影、冲洗即可。 注意：滤纸显色干操后或紫外灯照射下，用铅笔将斑点轮廓描下来。七、Rf值确定为了能准确地、重复地测定Rf值，应注意以下几点：1、应使用同规格的滤纸，并经过相同方法处理；2、用同一种方法处理样品，加样量应一致；3、使用新鲜配制的相同溶剂，试剂应选用分析纯或经相同方法纯化。4、展层前充分平衡，平衡和层析用相同温度；5、展层时间一致。相同条件

8、下，各种物质的Rf值分别是一个常数，与标准物质的Rf值比较可以定性地判断该分离组分是何种物质。如果溶剂流出滤纸，溶剂前沿无法确定，可以一标准物的位置作参照，按下式计算Rf值：影响Rf值的主要因素1、样品本身的性质与结构物质极性的大小决定了物质在水和有机相之间的分配情况，例如酸性或碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，因此Rf值较低；物质的极性取决于它所具有的极性基团的性质和数量；常见的极性基团有羧基、氨基、羟基与酮基等。在同系物中，疏水性的亚甲基基团增加，物质极性会降低。草酸、丙二酸、玻泊酸的Rf值大小?2、溶剂的性质溶剂系统的组成一与性质的改变直接影响分配系数，自然也会影响Rf值。溶剂系统极性增加，

9、物质的Rf值变大。溶剂系统的极性取决于有机溶剂分子本身的极性及溶剂系统所含的其他极性物质的量，特别是含水量。3、pH值pH对Rf值的影响主要由pH与分配系数的关系决定。由于溶剂的pH值改变，溶质的解离度增大，极性增强。就氨基酸而言，pH值的改变对酸性及碱性氨基酸的Rf影响较大，对中性氨基酸的Rf影响较小。4、展层温度由于水在有机相中的溶解度随着温度的改变而变化，囚此温度改变可以影响Rf值。对温度敏感的溶剂体系，在层析分离时必须严格控制温度。5、滤纸的性质滤纸厚薄一致不匀，溶剂沿纤维方向的流动就会紊乱，溶剂扩展不一致，造成溶剂前沿不整齐，分离点畸形。滤纸中金属离子含量较高时容易与被分离物形成配合物，