两大实验：质粒DNA 提取,质粒转化和筛选

1、DNA重组技术重组技术DNA recombination technology 基本策略目的基因的获取目的基因的获取质粒的提取制备质粒的提取制备重组子（杂化重组子（杂化DNADNA）体外重组（连接）体外重组（连接）转化转化感受态细胞感受态细胞筛选阳性转化子筛选阳性转化子获得子代重组获得子代重组DNADNA筛选筛选扩增扩增实验一实验一 碱裂解法小量提取碱裂解法小量提取质质粒粒 DNA质粒质粒 (plasmid)(plasmid)定义定义：是存在于细菌染色体外的双链环状：是存在于细菌染色体外的双链环状DNA。具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等

2、特性，与细菌的遗传变异有细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。关。作用：作用：携带外源基因进入细菌中扩增或表达的携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作用。用。 在在碱性环境碱性环境中，细菌膜破裂释放内容物。染中，细菌膜破裂释放内容物。染色体色体DNA变性分开变性分开，而质粒，而质粒DNA虽虽变性变性但仍处于但仍处于缠绕状态缠绕状态。将。将pH调至中性调至中性并有并有高盐高盐存在及存在及低温低温的的条件下，染色体条件下，染色体DNA、大分子量的、大分子量的RNA和蛋白质和蛋白质在在SDS的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形

3、成沉淀，而质粒DNA仍然为仍然为可可溶状态溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到纯化得到质粒质粒DNA。碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNA实验原理实验原理 1.细菌的培养细菌的培养 2.细菌的收集和裂解细菌的收集和裂解 3.质粒质粒DNA的分离和纯化的分离和纯化 4.质粒的鉴定质粒的鉴定碱裂解法提取质粒DNA主要步骤1. 取单克隆细菌至培养液中，取单克隆细菌至培养液中，37、200 rpm 摇摇床培养过夜。床培养过夜。2. 取取1.5 ml过夜培养菌液放于过夜培养菌

4、液放于EP管中，管中，12 000 r/min离心离心30s，弃去上清液。，弃去上清液。3. 加加100 l 溶液溶液，剧烈震荡使菌体，剧烈震荡使菌体悬浮均匀悬浮均匀，室温放置室温放置5min。4. 加加200 l 溶液溶液（现配现用现配现用），轻柔颠倒混匀），轻柔颠倒混匀46次，室温放置次，室温放置4min。操作过程5. 加入加入150l预冷的预冷的溶液溶液 ，轻柔颠倒混匀，轻柔颠倒混匀46次次，冰上放置，冰上放置10分钟。分钟。6. 12 000 r/m离心离心10 分钟分钟(如果上清液仍然浑浊，如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心可将上清液移出，再次离心5分钟分钟）。将上清液。将

5、上清液转移至转移至EP管中加管中加等体积等体积Tris饱和饱和酚酚抽提一次，抽提一次，12 000r/min离心离心10分钟，取上清转移至分钟，取上清转移至EP管中管中7. 加加等体积等体积氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，取）抽提一次，取上清转移至上清转移至EP管中。管中。9.9. 吸出上清液，加吸出上清液，加2.52.5倍体积倍体积的无水乙醇，混匀，的无水乙醇，混匀，室温放置室温放置1010分钟，分钟，12 000r/min12 000r/min离心离心1010分钟，沉分钟，沉淀淀DNADNA。10.10.弃上清弃上清70%70%乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀2 2次，自然挥干。次

6、，自然挥干。11.11.所得所得DNADNA溶于溶于30-50 l30-50 l TETE中，用于后续试验。中，用于后续试验。若长期不用可置于若长期不用可置于-20-20保存。保存。溶液溶液I： 50 mmol/L葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl pH 8.0 10 mmol/L EDTA pH 8.0溶液溶液II： 0.2 mol/L NaOH 1% SDS (十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)溶液溶液III：29.4g乙酸钾乙酸钾 11.5ml冰乙酸冰乙酸 H2O至至100ml TE溶液溶液：10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0 1 mmol/L EDTA, pH

7、 8.0pGEMpGEM-T Easy Vector Plot-T Easy Vector Plot实验二实验二 氯化钙法进行质粒转化及筛选氯化钙法进行质粒转化及筛选细菌处于细菌处于0 ，在，在CaCl2低渗溶液（低渗溶液（0.1M）中，菌）中，菌体细胞膨胀成球形，体细胞膨胀成球形，DNA则与则与CaCl2形成抗形成抗Dnase的羟基磷酸钙复合物粘附于细胞表面，的羟基磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经经42 短时间热冲击处理，促进细胞吸收短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细

8、胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。所需的转化子。一、原理一、原理1. 氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性；的通透性；2. 热激后迅速转移到冰上：促使质粒热激后迅速转移到冰上：促使质粒DNA转移进入转移进入胞内；胞内；3. 这种转化方法适用于双链环状这种转化方法适用于双链环状DNA（质粒），线（质粒），线型型DNA不能采用此法。（在自然界自然发生的转化不能采用此法。（在自然界自然发生的转化过程中，进入细菌细胞中的为单链过程中，进入

9、细菌细胞中的为单链DNA。）。）原理原理二、材料与仪器二、材料与仪器1. 体外重组质粒体外重组质粒2. CaCl2法制备的感受态细胞（法制备的感受态细胞（Competent cells） 3. 水浴锅水浴锅4. 培养基培养基LB5. 移液器移液器6. 摇床摇床7. 冰盒（制冰机）冰盒（制冰机）感受态细胞及特点感受态细胞及特点 感受态是指细胞处于最适于摄取和容忍外来感受态是指细胞处于最适于摄取和容忍外来DNADNA的生理状态。感受态细胞特点为：的生理状态。感受态细胞特点为： 细胞表面暴露出一些可接受外来细胞表面暴露出一些可接受外来DNADNA的位点（以的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位

10、点充分溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。暴露）。 细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使透性增加，使DNADNA直接穿过质膜进入细胞）。直接穿过质膜进入细胞）。感受态细胞及特点感受态细胞及特点 受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。分子不易被切除或破坏。 受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定）。胞染色体相对稳定）。 不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、不存在载体的筛选基因

11、，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞。修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞。三、方法1. 将大肠杆菌将大肠杆菌DH5 在在 LB 平板上划线，平板上划线，37 培养培养1620hr（或过夜）（或过夜）2. 从平板上挑取一个从平板上挑取一个23 mm大小的单菌落移至大小的单菌落移至25 ml LB液体培养基中，液体培养基中，37 强烈振荡过夜强烈振荡过夜3. 取取1个三角瓶将菌液按个三角瓶将菌液按1100稀释接种，稀释接种，37 强强烈振荡培养烈振荡培养3 hr，此时细菌，此时细菌OD600= 0.20.4,为对为对数生长期或对数生长期前期数生长期或对数生长期前期I 感受态的制备4.

12、 将培养物置冰上将培养物置冰上10 min 后转移置离心管中后转移置离心管中, 4000 rpm, 4 离心离心 5 min5. 弃上清，加入弃上清，加入10 ml ( 50 ml 原培养物原培养物)冰浴冷的冰浴冷的0.1M CaCl2溶液溶液,致敏悬浮细胞，置于冰上致敏悬浮细胞，置于冰上10 min6. 4000 rpm, 4离心离心 5 min 回收细胞，弃上清，每回收细胞，弃上清，每50ml 原培养物再加入原培养物再加入2 ml 冰冷的冰冷的0.1 M CaCl2溶液，溶液，悬浮细胞悬浮细胞7. 按每份按每份200ul分装细胞，若不分装细胞，若不24小时内进行转小时内进行转化化,可在感受

13、态细胞中加入终浓度为可在感受态细胞中加入终浓度为10%的灭的灭菌甘油菌甘油,置于置于-70 冰箱保存。冰箱保存。 不同的转化方法，感受态的制备也略有不同！不同的转化方法，感受态的制备也略有不同！重复重复5-6 的操作，以使反应更完全，增加成功率！的操作，以使反应更完全，增加成功率！1.加加10 l 含含40 ng 的的DNA溶液至溶液至200 l 感受态细感受态细胞中，温和混匀，置于冰上胞中，温和混匀，置于冰上30 min2.42 热冲击热冲击90s，迅速放回冰上，将细胞冷却，迅速放回冰上，将细胞冷却12 min，加入，加入500 l LB（或者（或者SOC）培养基。）培养基。3.将转化后细菌

14、放置将转化后细菌放置37 ，200 rpm 振荡培养振荡培养45 min，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。 质粒转化1.取取200 l 转化混合物铺于转化混合物铺于LB+Amp（含有诱导（含有诱导物物 IPTG 及生色底物及生色底物 X-gal）平板上，室温放置）平板上，室温放置至液体被琼脂全部吸收，倒置平板于至液体被琼脂全部吸收，倒置平板于37培养培养1216 h(过夜过夜)2.取出平板，观察平板上菌落的颜色和形状，挑取出平板，观察平板上菌落的颜色和形状，挑选白色克隆进行选白色克隆进行PCR和质粒酶切验证。和质粒酶切验证。 涂板筛选白色克隆特点：白色克隆

15、特点：灰白，扁平，湿润灰白，扁平，湿润蓝白筛选筛选的原理 载体上携带一段细菌载体上携带一段细菌lacZlacZ基因的基因的肽编码序肽编码序列，其编码产物为列，其编码产物为-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽。当无外肽。当无外源源DNADNA插入时，质粒表达插入时，质粒表达肽。突变型肽。突变型Lac-Lac-E.coliE.coli 可表达该酶的可表达该酶的肽。单独存在的肽。单独存在的及及肽均无肽均无-半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达这两个肽时，宿主细胞内才有共表达这两个肽时，宿主细胞内才有-半乳糖苷半乳糖苷酶活性，这种现象称为酶活性，这种现象称为互补。互补。1.1.互补互补 当载体中当载体中-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（lacZlacZ）的）的-肽编码肽编码区内具有多克隆区域时，如果在重组质粒中插入片区内具有多克隆区域时，如果在重组质粒中插入片段使段使-肽失活，肽失活， 则宿主细胞内则不表达有功能的则宿主细胞内则不表达有功能的-半乳糖苷酶，则得到白色菌落。半乳糖苷酶，则得到白色菌落。 2.2. 在宿主菌内，在诱导剂在宿主菌内，在诱导剂IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代 D D半乳糖苷）条件下，半乳糖苷）条件下，-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-肽加