非甾体类抗炎药致肝功能损害的早期代谢机制研究

1、附件 1浙江省第十五届“杯”大学生课外学术科技竞赛申报书序号： 编码： 浙江省第十五届“大学生课外学术科技申报书杯”竞赛名称： 非甾体类抗炎药致肝功能损害的早期 代谢机制研究：温州医科大学学校申报者姓名（集体名称）： 金类别：自然科学类学术哲会科学类报告和学术科技发明制作A 类科技发明制作B 类说明1、申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2、申报者在填写申报目填写 A1 或 A2 表，根据情况时只需根据个人项目或集体项类别（自然科学类学术、哲学科学类报告和学术、科技发明制作）分别填写B1、B2 或 B3 表。所有申报者必须填报 D 表，可根据情况填写 C表。科技发明制作项目分为

2、A 类（科技含量较高）和 B 类（投入较少的小发明），请注明。3、表内项目填写用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可。4、序号、编码由浙江省第十五届“杯”大学生课外学术科技竞赛填写。5、学术报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文文本），请以 4 号楷体打印在 A4 纸上，附报书后，文章版面14.522cm。6、申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7、有关参赛事宜请向竞赛处咨询。A2 申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写；申报者情况姓 名女出生年月1994.10.1学校温州医科大学专 业医学影像学现学历本科在读年级大三学制5 年入学时间2013.9.

3、5非甾体类抗炎药致肝功能损害的早期代谢机制研究题目通讯地址浙江省温州医科大学宿舍区20 幢325006浙江省温州医科大学宿舍区16 幢常住地通讯地址浙江省温州医科大学宿舍区20 幢325006住宅合作者情况学历所在女21本科在读温州医科大学第一临床医学院女19本科在读温州医科大学仁济学院金男21本科在读温州医科大学仁济学院女20本科在读温州医科大学仁济学院资格认定学校学籍管理部门意见是否为 2017 年6 月1 日前正式在校的全日制非成人教育、非在职的各类高等院校学生（含专科生、本科生和）。是 否若是，其学号为： 1323030102（部门盖章）院系或导师意见本是否为课外学术科技或实践活动成果

4、是 否签名：2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。B1申报情况（自然科学类学术）NSAIDL 类致肝功能损害的早期代谢机制研究作品分类（ E ）A. 机械与（包括机械、仪器仪表、自动化、工程、交通、等）B. （包括计算机、电信、通讯、电子等）C. 数理（包括数学、物理、地球与空间科学等）D. 生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化工、环保等）撰写的目的和基本思路1. 研究目的通过代谢组学的方法研究非甾体抗炎药引起的肝损害后的小物质的代谢变化规律，找出早期损伤时的

5、标志物,阐明早期发病机制，借此来肝损伤的发生。2. 基本思路大鼠肝损伤模型的建造。大鼠分为 对照组（生理盐水） 阳性对照组（可待因），实验组（ 匹林、 芬），分别使用相应 建造肝损伤模型。 CYP450 酶代谢能力研究。应用 Cocktail 法测定大鼠CYP450 同工酶的代谢能力。大鼠的生化指标。应用血生化分析仪测定大鼠的肝功能等获得生理指标。大鼠代谢组学研究。使用气相色谱-质谱进行分析，找的科学性、先进性及独特之处1. 在研究内容上，本项目从 CYP450 酶代谢能力评价和生化检测各类转氨酶两种方法评价肝损伤。2. 使用代谢组学的方法从小代谢物代谢规律改变的角度， 研究非甾体抗炎的肝功能

6、损害机制。的实际应用价值和现实意义非甾体类抗炎药作为一种非处方药 现象严重，而肝作为在体内代谢与排泄的主要场所， 的 往往容易引起肝损伤的发生。虽然许多临床研究对非甾体抗炎药的疗效和毒性进行了广泛的上市后评估，但由于对其肝毒性的发生机制不甚清楚目前仍缺少有效的防治 。（1） 本项目可证明使用代谢组学方法从小 代谢物水平研究 性肝损伤机制的可行性。（2） 本项目对非甾体抗炎药引起肝损伤的标志物的筛选可为将来临 进行 性肝损伤的 提供参考依据。学术论文文摘Aspirin and ibuprofen are the most frequently prescribednon-steroidal an

7、ti-inflammatory drugs (NSAIDs) in the world. But both of them have some effect on the liver. In this project, 60 SD rats were selected for ming, to restore Aspirin and Blovens long-term drug use m, and use codeine and physiological saline for positive and negative controls, to find out the pathogene

8、sis of liver injury induced by non steroidal anti-inflammatory drugs. At present, we have successfully identified three kinds of markers, including trihydroxybutyric acid, l-Alanine and 2,2-Diethylacetamide through the analysis of serum metabonomics, We intend to use these three markers for early wa

9、rning to better prevent liver damage caused by drug abuse.匹林和芬是在全球范围内应用最广泛的两种非甾体抗炎。但是两者都对肝脏有一定的损伤作用。本项目选用 60 只 SD 大鼠进行建模，还原匹林和芬的长期用药模型，并使用可待因和生理盐水进行阳性及对照，来寻找非甾体抗炎所导致的肝损伤的发病机制。目前我们已经通过血清代谢组学分析， 寻找到三乙基丁酸、1-丙氨酸和 N，N 二乙基乙酰胺三种标志物。我们拟使用这三种标志物的提前 ，来更好的提前预防由于 所导致的肝损伤。在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上及所获1. 以学生为第一作者2 篇，分

10、别为 Pharmaceutical Biology（IF=1.546，已收录）和pharmacology（IF=1.733,正在投稿中）。2. 本项目获得浙江省第八届大学生学科竞赛获得校赛优胜奖。鉴定结果本研究实验数据可靠，研究方法独特可行，所获成果均由团队共同完成。请提供对于理解、评价所申报具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录1. Lee WM, Stravitz RT, and Larson AM. Introduction to the revised American Association for the Study of Liver Diseases Position Pap

11、er on acute liver failure 2011. HepatologyJ. 2012. 55(3): 965-7.2. Yamazaki H. Drug-induced liver toxicity studies: research into human metabolites clarifies their role in drug development. Drug Metab PharmacokinetJ. 2014. 29(2): 111.说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3分类请按的学术方向或所涉及的主要学科领域填写

12、；4、博士不在此列。申报材料（申报名称及数量，相关资料名称及数量）1. 申报书 1 份2. 申报1 篇3. 附件材料：（一）：学生（二）：课题获奖情况科研管理部门签章年月日C.当前国内外同类课题研究水平概述NSAID 虽然种类多，但是药理作用相似，主要是通过抑制环氧化酶，减少炎性介质 素的生成，产生抗炎、镇痛、解热的作用。在通过抑制环氧化酶产生疗效的同时，NSAID 也会产生一些与用药目的无关的不良反应如隐痛、恶心、呕吐、饱胀、嗳气、食欲减退等消化不良症状。肝毒性是 NSAID 严重的不良反应症状，但发病机制尚未完全阐明。现研究认为与 NSAID 介导的免疫反，活性 状态氧及其他自由基损伤，原

13、药或其代谢产物在体内过量蓄积等有关。后两者损伤机制都与细胞色素P450 酶 (CYP450) 的代谢激活相关。通常情况下，NSAID 经CYP450 酶代谢后失活，进一步发生结合反应而排出体外，一旦由于遗传学变异等因素使CYP450 酶的代谢能力发生改变，代谢的一些中间产物未分解，则易出现性肝损。 虽然，NSAID 的肝功能损害与 CYP450 酶的代谢能力密切相关，但是其临床表现并无特异性，可出现转氨酶升高、乏力、食欲不振、恶心呕吐、腹胀、巩膜皮肤、发热等表现，严重者可并发腹水(73.9%)、肝性脑病(60.9%)、继发肺部(43.5%)和腹腔(39.1%)，率达 55%。由于临床表现缺少特

14、异性，且 NSAID 常常与其他用药，使得对其诊断存在一定，难以早期发现。目前，在 CYP450 酶活力的评价上，常用 Cocktail 探针药法，即同时给以多种 CYP450 酶特异性的探针。通过测定探针代，来评价CYP450 同工酶的代谢能力。在小代谢物质研究上，常依据代谢组学的研究，即运用色谱、质谱、NMR、CE 等技术对生物样品中的代谢物进行分离、纯化和检测再对所获得数据进行分析处理，从而获取有用信息。说明：1由推荐者本人填写；2推荐者必须具有高级专业技术，并是与申报相同或相关领域的学者或专业技术（教研组集体推荐亦可）；3推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4推荐者所在签章仅被视为对推荐

15、者的确认。说明：1由推荐者本人填写；2推荐者必须具有高级专业技术，并是与申报相同或相关领域的学者或专业技术（教研组集体推荐亦可）；3推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4推荐者所在签章仅被视为对推荐者的确认。E浙江省处资格和形式意见处资格意见人（签名）：2017 年月日处形式意见人（签名）：2017 年月日处结果 不（签名）：2017 年月日非甾体类抗炎药致肝功能损害的早期代谢机制研究目录一、简介2二、背景5三、介绍6四、实验方法（一）实验内容7（二）实验方案7（三）实验步骤9五、实验结果（一） 肝功能评估结果10（二） 代谢组学结果11六、总结13七、价值14附件一：学生. 16附件二：课题获

16、奖情况38附件三：学生参与课题证明材料39非甾体类抗炎药致肝功能损害的早期代谢机制研究1.简介肝脏是在体内代谢与排泄的主要场所，外源性的在体内发挥治疗作用的同时，也会引起肝的毒性反应，最为严重的是造成致命性的肝功能衰竭。随着日益增加的品种，目前引起的肝功能损害的不断升高。非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAID）是一类具有解热、镇痛、抗炎、抗风湿作用的，其品种繁多，广泛应用于各种炎症、风湿以及类风湿、骨关节炎以及关节损伤等疾病，在我国已成为居于抗生素类之后的第二大临床最常用药。临床应用的有非甾体抗炎药几乎均有肝脏损害的可能, 涉及的用

17、药患者数量众多, 非甾体抗炎药性肝损伤需要引起重视。虽然许多临床研究对 NSAID 的疗效和毒性进行了广泛的上市后评估，但由于对其肝毒性的发生机制不甚清楚，目前仍缺少有效的防治。肝损害可进展成致命性的肝功能衰竭，严重威胁患者的生命安全，如何防范其发生已成为一个亟待解决的医学难题。因此，正视非甾体抗炎药的肝损伤是合理用药的必备条件，研究非甾体类抗炎的肝功能损害的发病机制，建立早期的诊断识别方法，防范其进展，对临床安全用药有重要的意义。肝毒性是 NSAID 最严重的不良反应症状，但发病机制尚未完全阐明。研究认为与 NSAID 介导的免疫反应，活性状态氧及其他自由基损伤，原药或其代谢产物在体内过量蓄

18、积等有关。后两者损伤机制都与细胞色素 P450 酶 (CYP450) 的代谢激活相关。CYP450 酶是肝内主要的代谢酶，有显著的遗传多态性，使间对同一 NSAID 的代存在差异。通常情况下，NSAID 经 CYP450 酶代谢后失活，进一步发生结合反应而排出体外，一旦由于遗传学变异等因素使 CYP450酶的代谢能力发生改变，代谢的一些中间产物未分解，则易出现性肝损伤。 虽然，NSAID 的肝功能损害与 CYP450 酶的代谢能力密切相关，但是其临床表现并无特异性，可出现转氨酶升高、乏力、食欲不振、恶心呕吐、腹胀、巩膜皮肤、发热等表现，严重者可并发腹水(73.9%)、肝性脑病(60.9%)、继

19、发肺部(43.5%)和腹腔(39.1%)，率达 55%。由于临床表现缺少特异性，且NSAID 常常与其他用药，使得对其诊断存在一定，难以早期发现。目前，在 CYP450酶活力的评价上，常用 Cocktail 探针药法，即同时给以多种 CYP450 酶特异性的探针，通过测定探针代，可同时评价多种 CYP450 同工酶的代谢能力。在小代谢物质研究上，常依据代谢组学的研究，即运用色谱、质谱、NMR、CE 等技术对生物样品中的代谢物进行分离、纯化和检测，再对所获得数据进行分析处理，从而获取有用信息。代谢组继基因组学、转录组蛋白质组学之后, 系统生物学的重要组成领域。代谢组指的是“一个细胞、组织或中,

20、所有代谢组分的集合, 尤其指小物质”, 而代谢组是一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律, 揭示机体生命活动代谢本质”的科学。细胞内的生命活动大多发生于代谢层面, 如细胞信号、能量传递、细胞间通信等, 故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。与蛋白质的表达紧密相连, 代谢物则地反映了细胞所处的环境。从病理生理上而言，当 NSAID 引起肝功能损害时，会引起其肝脏的代谢改变。这种病理生理改变必然会导致与之相关的机体内的一些小物质发生相应的代谢变化。这些小物质，可来自机体的新陈代可以是 NSAID 的肝代谢产物，但因为肝功能的损害，会使其代谢和排泄受到影响。这种影响，表现在血液

21、循环中，会呈现一定的代谢特征和变化规律。故我们选用代谢组学的方法来进行性肝损伤的机制研究，以期达到性肝损伤的。我们实验的目的就是通过代谢组学的方法研究非甾体抗炎药引起的肝损害后的小物质的代谢变化规律，找出早期损伤时的标志物,阐明早期发病机制，借此来肝损伤的发生。我们通过长期给药诱导大鼠肝损伤的发生，并使用生化检测和 cocktail 探针药法进行评估，然后使用代谢组学法测定体内代谢物质的变化，找出标志物。在本实验中我们已利用几种非甾体抗炎药制造出大鼠肝损伤模型，并找到 3 种标志物。2.背景研究显示美国每年的肝衰竭病例 50% 以上是引起，其中 36%为非甾体类抗炎药，且实际肝损害的例数为的

22、16 倍。在我国引起性肝损害的中有 23.2%为非甾体类抗炎药。应用非甾体抗炎药患者存在致命肝毒性的风险,可能导致急性肝衰竭(acuteliver failure, ALF)最终需要进行肝脏移植或致死。由于严重胆汁郁积性黄疸合并急性肝衰竭而进行肝移植的病例中, 美国50000例肝移植受者中有270 例是由于DILI 所致的急性肝衰竭ALF(0.5%)。最近研究, 我国人群中非甾体导致的DILI 占到总数的 7.6%。NSAID依据化学结构不同，分为甲酸类，乙酸类，丙酸类，昔康类，昔布类，吡唑酮类等等，其代表有匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、芬、萘普生、吡罗昔康、美洛昔康、塞来昔布、近、氨基比林、对乙

23、酰氨基酚等等。虽然种类多，但是药理作用相似，主要是通过抑制环氧化酶，减少炎性介质素的生成，产生抗炎、镇痛、解热的作用。在通过抑制环氧化酶产生疗效的同时，NSAID 也会产生一些与用药目的无关的不良反应如隐痛、恶心、呕吐、饱胀、嗳气、食欲减退等消化不良症状。肝毒性是 NSAID 不良反应症状之一，但发病机制尚未完全阐明。有研究认为与细胞色素P450 酶 (CYP450)代谢激活相关。虽然，NSAID 的肝功能损害与 CYP450 酶的代谢能力密切相关，但是其临床表现并无特异性，可出现转氨酶升高、乏力、食欲不振、恶心呕吐、腹胀、巩膜皮肤、发热等表现，使得对其诊断存在一定，难以早期发现。从病理生理上

24、而言，当 NSAID 引起肝功能损害时，必然会导致机体内的一些小物质发生相应的代谢变化。这种影响表现在血液循环中，会呈现一定的代谢特征和变化规律。故我们使用代谢组学的方法早期识别这些小物质的代谢改变规律，阐明 NSAID 的肝功能损害机制。3.介绍3.1匹林匹林的肝毒性呈剂量相关性, 通常无症状, 发生过敏性反应极少。高剂量出现轻度的血清ALT胆红素和AP升高。严重肝毒性多见于给予大剂量匹林(大于2-3 mg/d）,水杨酸盐浓度超过25mg/dL。继发性线粒体功能被认为是其引起肝毒性的主要机制。在发生的儿童和青少年中合并用匹林时发生Reye综合征的风险可能会增加, 但相关性尚未得以证实, 持续

25、地呕吐可能是Reye综合征的信号。在儿童和青少年中应慎用匹林。延边大学附属医院收治了1例仅服用2片匹林后发生严重性肝损伤的患者,伴有自身抗体阳性,经过糖皮质激素治疗后治愈。3.2芬在常用的非甾体中芬肝毒性是最小的芬致肝损伤最常见的类型是肝细胞型和胆汁淤积型, 与长期胆汁淤积和胆管消失综合征具有相关性芬所致DILI导致ALF和致死病例罕见。总的来说,芬在肝脏方面的安全性较高。3.3 可待因可待因是一种常用的止咳药，是我国者使用最多的成瘾物质，有片剂和各种含可待因的口服液，除片剂列入管理外，其他制剂都较易得到，大部分在肝内代是容易引起肝损伤的常见。可待因属阿片类，通过作用于中枢神经系统特定部位达到

26、疗效，作用机制与非甾体不同，因此我们选为阳性对照药。4.实验方法4.1 实验内容临，非甾体抗炎药种类繁多，我们主要匹林，芬等常用的两个代表。应用“Cocktail”探针法研究 NSAID单独使用引起肝损害时的 CYP450 酶的代谢能力，测定每个探针在肝肾损害时的大鼠体内不同时间段的代，获取 CYP450 同工酶的代谢能力变化；非甾体抗炎药的浓度运用 LC-MS 技术进行检测；采用 GC-MS 和飞行质谱测定小物质的代谢变化。4.2 实验方案非甾体抗炎药的大鼠分组。六十只雄性SD 大鼠随机分为四组，对照组生理盐水（n=15），阳性对照组可待因（n=15），匹林组（n=15），芬组（n=15），

27、四组每天分别灌胃生理盐水（给药浓度0.15ml/100g）、可待因（浓度10mg/ml 给药浓度0.1ml/100g），实验组匹林（浓度10mg/ml 给药浓度0.15ml/100g）和芬（浓度10mg/ml 给药浓度0.15ml/100g），建立大鼠肝损伤模型。 CYP450 酶代谢能力研究。应用 Cocktail 法测定大鼠CYP450 同工酶的代谢能力，大鼠给药前一天将大鼠置于代谢笼中（禁食，不禁水），次日大鼠按体重给以种探针(非那西丁、丁氨苯、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、)。给药前取空白血，给药后 0.25-36h 分别从尾静脉采血0.3ml，2000rmp 离心10min，置-2

28、0，。大鼠代谢组学研究a.样品处理 取100L血清,加入乙腈250L，涡旋1min，冰浴10min 后，离心分离（13000,4C，10min）。取一定体积上清液，置1.5mlEP 管，膜封住，用细针插小孔，- 80C 冷冻，再冷冻干燥机上干燥24h。加15mg/mL 甲氧胺吡啶溶液50L 混匀，70C 下1h 后加衍生化试剂50L，混匀静置。1h 后加正庚烷150L，混匀后离心分离，移取上清液到瓶中的内衬管，供GC-MS 跑样。b.统计分析 SPSS样本t 检验，以检测两组之间的所有代谢产物的显着差异。P 值小于0.05 被认为是有统计学意义。大鼠的生化指标。应用血生化分析仪测定大鼠的肝肾功

29、能等获得生理指标。大鼠从尾部静脉采血，采取时间和 CYP450 酶及代谢组学的实验同步。肝功能检测项目包括：转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、间接胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素、肌酐、尿酸。4.3 实验步骤非甾体抗炎药肝损伤机制研究阴性对照组阳性对照组实验组一实验组二5.实验结果5.1 肝功能评估结果5.1.1 生化检测结果：在1、2、3 周分别检测出转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶（AKP）。结果显示正常对照组、匹林组和芬三组之间有统计学差异,且在第三都有增加。2 weeka3 weekbindex1 week

30、ALT51.7319.6757.8712.0661.5317.56Control groupAST202.9365.51199.2724.57219.6073.44AKP288.5356.29268.3378.30305.13112.85ALT61.7321.3766.5317.0480.2024.01Aspirin groupAST196.2760.83219.2764.08287.6081.62AKP298.5348.84321.6776.92365.1388.33ALT64.4023.8971.8724.2586.8737.52Ibuprofen groupAST249.6083.713

31、25.93102.81334.27125.06AKP285.2055.90335.0094.07358.4779.735.1.2 CYP450 酶代谢能力检测结果实验组大鼠几种探针CYP450 酶的探针(非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、)在体内达峰时间延迟。5.1.3 讨论GPT 主要存在于肝细胞浆内，其胞内浓度高于血清中 1000-3000倍。只要有 1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。但它并不具专一性，许多疾病都可以引起它的增高。明显升高见于急毒性肝炎，中度升高见于慢性肝炎、肝硬化活动期、肝癌、肝脓肿，心

32、梗、心肌炎、心衰等也可轻度升高。因此对 GPT 升高的评价切结合临床。CYP450 酶是肝内主要的代谢酶，其代谢能力与肝功能损害密切相关。几种探针在体内的达峰时间延迟可说明 CYP450 酶代谢能力减弱。结合以上两种结果可得出我们通过长期给大鼠服用非甾体抗炎药已造成其肝损伤。5.2 代谢组学结果实验前后葡萄糖、d-甘露糖、胆固醇、琥珀酸、甘氨酸等几种代谢物质指标相对增高（表 5.1 ），通过以上代谢物的异常,我们初步推测长期使用非甾体抗炎会使糖、脂、蛋白三种物质的代谢出现紊乱。并得出三乙基丁酸、丙氨酸和，N,N-二乙基乙酰胺是匹林组（表 5.2）和芬组（表 5.3）大鼠血清中最重要的标志物。表

33、 5.1：第一周第二周第三周NO. vip代谢物vip代谢物vip代谢物TrihydroxybutyriTrihydroxybutyri15.86.3l-Alanine6.5c acidc acid分组代谢复合物匹林芬代谢途径葡萄糖*能量代谢d-甘露糖*脂类代谢胆固醇*脂类代谢琥珀酸*能量代谢甘氨酸*能量代谢Trihydroxybutyri23.6Galacturonic acid4.53.1D-Galactosec acid32.8l-Alanine2.9Acetamide2.6Galacturonic acid42.8Propanedioic acid2.2Diethylacetamide

34、2.4Butanoic acid52.2Diethylacetamide2.1Butanoic acid1.9Diethylacetamide61.5Arachidonic acid2.0Propanedioic acid1.9Acetamide71.5Butanoic acid1.9Silylamine1.8Propanedioic acid81.4D-Galactose1.9Ethanedioic acid1.8L-Tyrosine91.4d-Glucose1.8Propanoic acid1.7Arachidonic acid101.3Hexanoicacid1.5Galacturoni

35、c acid1.5Diethylacetamide表 5.2匹林组主要代谢物变化表 5.3芬组主要代谢物变化第一周第二周第三周NO.vip代谢物vip代谢物vip代谢物2,2-DiethylacetaTrihydroxybutyri14.25.3l-Alanine5.3midec acidTrihydroxybutyriTrihydroxybutyri23.73.64.5Diethylacetamidec acidc acid33.0Galacturonic acid3.3Propanedioic acid4.0Acetic acid42.4Ethanedioic acid2.8Galacturonic acid3.1L-Valine52.3Galacturonic acid2.0Di