基因克隆及克隆基因的表达

1、LOGO吉林大学白求恩医学院吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室分子生物学教研室 讲讲 师师 孙孙 巍巍Tel: 0431 - 856193692012-10LOGO荧光蛋白基因克隆猫 科学家复活冰冻死老鼠修正基因蚊子防控疾病基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛基因克隆胚芽造就健康婴儿基因克隆趣闻基因克隆趣闻LOGO荧光蛋白基因克隆猫荧光蛋白基因克隆猫具有荧光蛋白基因的克隆具有荧光蛋白基因的克隆猫在紫外线照射下会变色猫在紫外线照射下会变色由韩国科学技术部公布的对比由韩国科学技术部公布的对比照片显示出照片显示出3只具有荧光蛋白只具有荧光蛋白基因的克隆猫（上图为普通光基因的克隆猫（上图为普通光线照射下，下

2、图为紫外线照射线照射下，下图为紫外线照射下）下） LOGO科学家复活冰冻死老鼠科学家复活冰冻死老鼠一只老鼠死亡后被冷冻了一只老鼠死亡后被冷冻了1616年之久年之久, ,日本科学家从其体内日本科学家从其体内提取基因克隆了一只新老鼠提取基因克隆了一只新老鼠, ,这这是人类首次成功克隆冷冻动物是人类首次成功克隆冷冻动物。LOGO修正基因蚊子防控疾病修正基因蚊子防控疾病科学家把一种可防疟疾的科学家把一种可防疟疾的基因植入蚊子基因之中基因植入蚊子基因之中,对蚊对蚊子基因进行修正。子基因进行修正。在实验中在实验中,科学家们不仅科学家们不仅仅在蚊子体内植入了防疟疾基仅在蚊子体内植入了防疟疾基因因,还植入了另

3、一种可以使蚊还植入了另一种可以使蚊子眼睛发出荧光的基因。这样子眼睛发出荧光的基因。这样,科学家就可以很容易识别它科学家就可以很容易识别它们。们。LOGO基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛2007年年,英国科学家在实验室英国科学家在实验室中利用基因转换技术成功地在蝌中利用基因转换技术成功地在蝌蚪头部培育出第三颗眼球。这个蚪头部培育出第三颗眼球。这个消息对盲人来说是一个天大的喜消息对盲人来说是一个天大的喜讯。利用这种技术讯。利用这种技术,干细胞科学家干细胞科学家们真的有可能实现他们再造眼球们真的有可能实现他们再造眼球的梦想。的梦想。LOGO基因克隆胚芽造就健康婴儿基因克隆胚芽造就

4、健康婴儿基因的秘密随着科技的日益发达而基因的秘密随着科技的日益发达而被逐渐揭开。血友病、色盲、白化被逐渐揭开。血友病、色盲、白化病病这些遗传病困扰着一个又一这些遗传病困扰着一个又一个家庭，也激励着一代又一代科学个家庭，也激励着一代又一代科学家为之奋斗。家为之奋斗。LOGO 分子生物学关键的技术突破：分子生物学关键的技术突破： DNA重组技术重组技术1972年，年，世界上第一个重组世界上第一个重组DNA分子诞生分子诞生Paul Berga biochemistry at Stanford猿猴病毒猿猴病毒DNA 噬菌体噬菌体DNA限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶

5、重组重组DNA分子分子1980年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖LOGO 克隆：通过克隆：通过过程所产生的与亲代过程所产生的与亲代的子代群体。的子代群体。moleculeCell colonyorganismDNA clone基因克隆基因克隆: : 是指来自不同生物的是指来自不同生物的同有自主复制同有自主复制能力的能力的在在人工连接，构建成新的人工连接，构建成新的，然后送入受体生物中去表达，从而，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质转移和重新组合。产生遗传物质转移和重新组合。 LOGO 一、目的一、目的DNA的的分分离获取（分）；离获取（分）；二、载体的选二、载体的选择择与准备（择）；

6、与准备（择）；三、目的三、目的DNA与载体连与载体连接接（接）；（接）；四、重组四、重组DNA转转入受体细胞（转）；入受体细胞（转）；五、重组体的五、重组体的筛筛选与鉴定（筛）。选与鉴定（筛）。DNA克隆的过程包括五个基本部分：克隆的过程包括五个基本部分：LOGO 一、目的一、目的DNA的分离获取（分）的分离获取（分）分离获取目的分离获取目的DNA有多种方法：有多种方法：(一一) PCR待扩增目的基因两端序列已知待扩增目的基因两端序列已知（据此设计引物）（据此设计引物）(二二) 基因文库基因文库先构建，后筛选先构建，后筛选(三三)化学合成法化学合成法直接合成目的直接合成目的DNA（序列已知、片

7、段较短）（序列已知、片段较短）LOGO 随机打碎：随机打碎：物理方法物理方法 缺点：难以重复；获得的缺点：难以重复；获得的DNADNA量少等。量少等。LOGO 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现的发现1970年，年，第一个限制性核酸内切酶第一个限制性核酸内切酶剪切剪切DNA操作操作DNA1978年，年，获诺贝尔生理学或医学奖获诺贝尔生理学或医学奖限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNALOGO 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 Restriction endonucleasel可分为可分为、型，分子生物学中通常使用的是型，分子生物学中通常使用的是型型：能在能在DNA双链内部的

8、双链内部的特异特异位点识别并切割位点识别并切割DNA，“分子剪刀分子剪刀”GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H核酸水解酶，裂解磷酸二酯键。核酸水解酶，裂解磷酸二酯键。LOGO 型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：1. 具有特定的识别和切割位点具有特定的识别和切割位点 限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点Apa IGGGCCCCCCGGGSma ICCCGGGGGGCCCBamH IGGATCCCCTAGGSau 3A IGATCCTAGPst ICTGCAGGACGTCNot IGCGGCCGC

9、CGCCGGCGEcoR IGAATTCCTTAAGSfi IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG II型限制性内切酶的识别位点举例（型限制性内切酶的识别位点举例（示切割位点）示切割位点） 识别位点通常为识别位点通常为6或或4碱基序列碱基序列LOGO 2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 两条核苷酸链中，从两条核苷酸链中，从5到到3方向的核苷酸序列完全一致方向的核苷酸序列完全一致型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGO 3. 切割双链切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端

10、Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口（sticky end） （blunt end） 型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGO 粘性末端又可分为两种：粘性末端又可分为两种：1 1）5 5 - -端突出端突出2 2）3 3 - -端突出端突出CTGCAOH GG HOACGTC5 3 5 3 -5 5 -PstICTGCA G C ACGTC5 5 3 3 GOH AATTC.CTTAA HOG5 3 -5 5 -5 3 EcoRIGAATTC CT

11、TAAG5 3 5 3 LOGO 4. 不同的酶可以产生同样的末端不同的酶可以产生同样的末端 同尾酶同尾酶（isocaudarner）：）：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A互连后？互连后？型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有

12、一些共性和特性：LOGO 5. 不同的酶可以识别同一个序列不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶）或同裂酶能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。 GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG GXmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSma为为DNA操作增加了酶的可选余地操作增加了酶的可选余地型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有

13、一些共性和特性：LOGO 6. 切割会受其他因素的影响切割会受其他因素的影响l 通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。l 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。如，如，EcoR I在正常情况下识别在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油序列，但在甘油浓度大于浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，这种现象称为，这种现象称为（），以），以EcoR I*表示。表示。型限制性内切酶具

14、有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGO M6. 切割会受其他因素的影响切割会受其他因素的影响5.不同的酶可以识别同一个序列不同的酶可以识别同一个序列 4. 不同的酶可以产生同样的末端不同的酶可以产生同样的末端 3. 切割双链切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 1. 具有特定的识别和切割位点具有特定的识别和切割位点 型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：在在DNA双链内部的特异位点识别并切割双链内部的特异位点识别并切割DNALOGO

15、文库法：文库法：一个细胞只接受一个一个细胞只接受一个重组重组DNA分子分子一般一个载体只携带一般一个载体只携带一段外源一段外源DNA 单克隆单克隆LOGO 基因组基因组DNADNA文库（文库（genomic DNA librarygenomic DNA library）：）：包含某一个生物细胞或组织全部基因组包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNADNA序列的随机克序列的随机克隆群体，以隆群体，以DNADNA片段的形式贮存了所有的基因组片段的形式贮存了所有的基因组DNADNA信息。信息。如何从文库中钓取基因？如何从文库中钓取基因？LOGO 用用带有标记的带有标记的、已知序列的核酸片段已知序列的

16、核酸片段 (单链单链RNA或或DNA)来检测被测样品中来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量。标序列的量。LOGO 转膜、转膜、变性、变性、封闭、封闭、加入变性的探针、加入变性的探针、杂交、杂交、洗涤、洗涤、检测杂交体。检测杂交体。LOGO 如何实现特异性的获得目的基因？如何实现特异性的获得目的基因？LOGO 聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction, PCR体外高效体外高效特异性特异性的扩增目的的扩增目的DNA片段片段LOGOLOGOLOGOLOGOLOGO1234522557294时间（m

17、in）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍LOGOLOGO()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20LOGOLOGOPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0 0.1 12ug2ugTaq DNATaq

18、 DNA聚合酶聚合酶 2 2.5u5uMgMg2+ 2+ 1 1.5mmol/L5mmol/LLOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点50引物1引物2DNA引物LOGOPCRPCR的基本原

19、理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点第1轮结束95第2轮开始LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点72TaqTaqTaqTaqLOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点72第2轮结束LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCR

20、PCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增LOGO PCR Primer DesignlPCR反应中有两条引物，即反应中有两条引物，即5引物和引物和3引物。引物。553355First cycleATG TAAATG TAA33Target sequence下游引物、下游引物、3 引物、引物、antisense primer上游引物、上游引物、5 引物、引物、Sense primerl 引物设计的引物设计的。l PCR反应扩增的就是一对引物之间的反应扩增的就是一对引物之间的DNA片段，片段，PCR

21、反应反应成功扩增的关键在于引物的正确设计。成功扩增的关键在于引物的正确设计。LOGOPCR引物设计的基本原则：引物设计的基本原则：1.引物与模板的序列要紧密互补。引物与模板的序列要紧密互补。2.引物自身、引物之间不应存在互补序列。引物自身、引物之间不应存在互补序列。3.引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发PCR。 LOGO 长度：长度：特异性序列一般特异性序列一般15-18bp15-18bp。 碱基分布：碱基分布： 引物方向：引物方向：5 5 33 引物的引物的3 3 端端：是：是DNADNA延伸的起点，一定要严格与模板延伸的起点，一定要严格与模板DNADNA配对。配对

22、。 引物的引物的5 5 端端：可以加非特异性序列：可以加非特异性序列, ,如酶切位点等。如酶切位点等。 同源性比较同源性比较：引物与非特异扩增序列的同源性不要：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过超过70%70%或有连续或有连续8 8个互补碱基同源。个互补碱基同源。 PCR引物设计的具体方法：引物设计的具体方法：尽量随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。尽量随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。GCGC比在比在45-55%45-55%。33和和55引物具有相似的引物具有相似的TmTm值。值。Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)。LOGOPCR引物的设计实例引物的设计

23、实例已知已知IFN- cDNA序列如下序列如下, 该如何设计该如何设计PCR引物？引物？at gaaatataca agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac agaaaaataa tgcagagcca attgtctcc ttttacttca a

24、actttttaa aaactttaaa gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca tcccagtaa LOGO

25、at gaaatataca agtgaagagca tcccagtaaatgaaatatacaagt3535上游引物结合上游引物结合cttctcgtagggtcatt下游引物结合下游引物结合设计引物时设计引物时: 特异性序列：特异性序列：5引物照抄，引物照抄，3引物互补倒读，引物互补倒读，即：即： 5引物与位于待扩增片段引物与位于待扩增片段5上游的一小段上游的一小段DNA序列相同序列相同; 3引物与扩增片段引物与扩增片段3端的一小段端的一小段DNA序列互补。序列互补。 酶切位点酶切位点加在引物的加在引物的5；调调GC含量的碱基含量的碱基放在最前边；放在最前边； 此外，无发夹结构、与基因组其它区

26、域的同源性较差。此外，无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。5335LOGO Sense primer: 5CGCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT315 bpGC=12 AT=15Anti-Sense primer:5ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC317 bpBamHI start codonGC=12 AT=15EcoRI stop codon引物的方向是引物的方向是5 3 ：at gaaatataca agtgaagagca tcccagtaaatgaaatatacaagt3535上游引物结合上游引物结合cttctcgtagggtcatt

27、下游引物结合下游引物结合5335LOGO Electrophoresis PCR产物中产物中只含有只含有目的目的DNA片段吗？片段吗？MLOGO 二、载体的选择与准备（择）；二、载体的选择与准备（择）；载体（载体（vectorvector）：携带外源）：携带外源DNADNA，实现外源，实现外源DNADNA在受体细胞中在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。 1.按功能按功能克隆载体（克隆载体（cloning vector）表达载体（表达载体（expression vector） 2.按基本元件按基本元件的来源的来源

28、分类：分类：质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体黏粒载体黏粒载体病毒载体病毒载体人工染色体载体等人工染色体载体等LOGO 二、载体的选择与准备（择）；二、载体的选择与准备（择）；（一）根据（一）根据DNA克隆的克隆的目的目的选择与准备适宜载体选择与准备适宜载体1. 获得目的获得目的DNA片段片段选用选用克隆载体克隆载体；2. 获得目的获得目的DNA片段所编码的片段所编码的蛋白质蛋白质选用选用表达载体表达载体。（二）考虑目的（二）考虑目的DNA的的大小大小及受体细胞的种类和来源及受体细胞的种类和来源载体载体插入插入DNADNA片段片段宿主细胞宿主细胞质粒质粒510 kb细菌，酵母细菌，酵母噬菌体

29、载体噬菌体载体 20 kb细菌细菌黏粒黏粒50 kb细菌细菌BACBAC400 kb细菌细菌YACYAC3Mb酵母酵母（三）含有合适的（三）含有合适的MCSLOGO克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖 （一）克隆载体（一）克隆载体（cloning vector）应具备的主要特点应具备的主要特点1.1.至少有一个至少有一个复制起点复制起点（origin of replication, oriorigin of replication, ori）2.2.至少有一个至少有一个选择性标志选择性标志（selection markerselection marker）3.

30、3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点多克隆位点（multiple multiple cloning sitescloning sites，MCSMCS）4.4.应有较高的拷贝数应有较高的拷贝数pBR322pBR322质粒图谱质粒图谱 LOGO 克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类1.1.质粒质粒(plasmid)(plasmid)是最常用的克隆载体是最常用的克隆载体l广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中l独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超

31、螺旋结构独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构l能在宿主细胞内能在宿主细胞内独立自主复制独立自主复制l带有某些遗传信息带有某些遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些会赋予宿主细胞一些遗传性状遗传性状l质粒的不相容性质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。LOGO 目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳10kb10kb以内的外源以内的外源DNA DNA 。pUC18/19pUC18/19质粒图谱质粒图谱pUC18/19pUC18/19质粒，质粒，2686bp2686bp，是最常用的质

32、粒载体，是最常用的质粒载体缺乏控制拷贝数的缺乏控制拷贝数的roprop基因，因此其拷贝数达基因，因此其拷贝数达500-700 500-700 LOGO T-T-载体：载体：pMD18-T2692bpAmpicillin resistanceoriginHindIIISplnPstIHincIIAccISalIXbalBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRISp6T7LacZTTLOGO 克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类2.2.噬菌体噬菌体(phage)(phage)能感染细菌的病毒能感染细菌的病毒

33、（1 1）噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统coscos位点位点: :两端各有一条由两端各有一条由1212个碱基组成、彼此完全互补且个碱基组成、彼此完全互补且55突出的序突出的序列列插入型：插入型：gtgt系列，适用于系列，适用于cDNAcDNA克隆克隆置换型：置换型：EMBLEMBL系列，适用于基因组系列，适用于基因组DNADNA克隆克隆线性双链线性双链DNADNA分子分子coscos12bp12bp48500bpNonessential portionfor replicationLong (left) armShort (right) arm（2 2）M13M13噬菌体噬菌体DNA

34、DNA改造系统（含改造系统（含lacZlacZ基因）基因） 单链闭合环状单链闭合环状DNADNA分子分子LOGO 克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类3.3.穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用可在不同宿主细胞中应用人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNADNA序列在不同种类序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。宿主细胞中复制、扩增。例如，既能在原核生物中复制例如，既能在原核生物中复制, ,又能在真

35、核生物中复制的载体。又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因），通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表达分析。在酵母菌中用于基因表达分析。LOGO 表达载体用于外源表达载体用于外源DNA的表达的表达 表达载体（表达载体（expression vectorexpression vector）：用来在宿主细胞）：用来在

36、宿主细胞中中表达外源基因表达外源基因的载体的载体 依据其宿主细胞的不同可分为依据其宿主细胞的不同可分为: : 原核原核表达载体（表达载体（prokaryotic expression vectorprokaryotic expression vector） 真核真核表达载体（表达载体（eukaryotic expression vectoreukaryotic expression vector） LOGO 三、目的三、目的DNA与载体连接（接）与载体连接（接）T4DNA ligaseLOGO Ligation EcoRIEcoRIRE digestion VectorEcoRIVectorR

37、E digestion RecombinantvectorRecombinantvectorRecombinantvectorEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI 单酶消化的粘性末端连接：单酶消化的粘性末端连接：连接效率高连接效率高; ; 载体需去磷酸载体需去磷酸; ;双向连入载体双向连入载体LOGO VectorSmaIHeaIIISmaIRE digestionRE digestionVectorLigation Helf of smaIRecombinantvectorSmaIHelf of HeaIIIRecombinantvectorSamIHelf of smaIHe

38、lf of HeaIII 平头末端连接：平头末端连接：连接效率低连接效率低双向连入载体双向连入载体自身环化率高自身环化率高LOGOTarget geneEcoRIBamHIEcoRIBamHIVectorVectordigestiondigestionLigation VectorEcoRIBamHI 双酶消化的粘性末端连接：双酶消化的粘性末端连接：连接效率高连接效率高; ;定向连接定向连接. . LOGO Vector EcoRVEcoRV digestionVector Taq DNA polymerasedTTPT-Vector 55 TT55AAPCR productRecombina

39、ntvector AATTPCR productLigation T-A T-A粘性末端连接：粘性末端连接：连接效率高连接效率高双向双向连入载体连入载体 自身环化率自身环化率LOGO 四、重组四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）转入宿主细胞进行扩增（转）感受态细胞（感受态细胞（competent cell）：）：处于易于接纳外源物质的状态的细菌处于易于接纳外源物质的状态的细菌LOGO转化转化（transformation） 质粒或黏粒质粒或黏粒细菌细菌 质粒质粒酵母酵母（真核细胞）（真核细胞）转染转染（transfection） 外源外源DNA真核细胞（酵母除外）真核细胞（酵母除外）感染感

40、染（infection） 噬菌体颗粒噬菌体颗粒细菌细菌 病毒颗粒病毒颗粒哺乳细胞哺乳细胞 几个相关概念：几个相关概念：LOGO 将重组将重组DNA转入受体细胞的常用方法：转入受体细胞的常用方法：化学法：化学法： 氯化钙法氯化钙法物理法：物理法： 电击法电击法 显微注射法显微注射法 等等LOGO 氯化钙化学转化法氯化钙化学转化法LOGO 电击法电击法利用瞬间高压在细胞上打孔利用瞬间高压在细胞上打孔LOGO 显微注射法显微注射法LOGORecombinantvectorRecombinantvectorRecombinantvectorRecombinantvector连接产物连接产物感受态细胞：

41、感受态细胞：E.coliLigation mixture LOGO筛选出含有筛选出含有(目的基因目的基因+载体载体)的克隆的克隆 转化后的克隆群体：转化后的克隆群体：LOGO 五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）1. 抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选2. 蓝白筛选蓝白筛选3. 限制性内切酶法限制性内切酶法4. PCR法法5. DNA测序法测序法主要方法：主要方法：LOGO 五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：无载体转入的细胞无载体转入的细胞dead；含有载体的细胞；含有载体的细胞aliv

42、e。1. 利用利用抗生素抗性标志抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子可筛选出带有载体的重组子尚需进一步鉴定载体是否为含有目的尚需进一步鉴定载体是否为含有目的DNA的重组载体的重组载体LOGOIPTGBlue-white screening of recombinantsLac Operon ?在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）2. 蓝白筛选蓝白筛选 LOGOBlue colonyIPTG X-gal Blue cell. LOGO如果外源基因插入位于如果外源基因插入位于LacZ基因内部的

43、多克隆基因内部的多克隆酶切位点，则不能通过酶切位点，则不能通过-互补编码互补编码-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，菌落呈菌落呈。-互补互补带有带有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端端的编码序列的编码序列带有带有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端的编码序列的编码序列蓝白筛选的基本原理：蓝白筛选的基本原理：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶可分解培养物中的可分解培养物中的X-gal，使其呈，使其呈。 LOGO 3. 限制性内切酶法限制性内切酶法：根据限制酶切图谱筛选特定根据限制酶切图谱筛选特定DNA五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）Linear vector (2700bp)insert (300bp)

44、M 空质粒空质粒 重组质粒重组质粒NcoIHindIII2700bp300bp提取阳性克隆的重组提取阳性克隆的重组DNARE消化消化电泳电泳有无有无DNA片段的插入；片段的插入；插入片段的大小插入片段的大小连接前用什么酶，连接前用什么酶，就用什么酶切就用什么酶切LOGO 可明确序列和阅读框的正确性可明确序列和阅读框的正确性 5. 核苷酸序列测定核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的是最准确的鉴定目的DNA的方法的方法 五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）l利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。l如利用克隆位点两侧序列设计引物进行如利用克隆位点两侧

45、序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，能，再结合序列分析，能可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。 4. PCR法法：直接鉴定目的：直接鉴定目的DNA的存在的存在LOGO 基因工程（基因工程（genetic engineering）重组重组DNA技术（技术（recombinant DNA technology）分子克隆（分子克隆（molecular cloning）DNA克隆（克隆（DNA cloning）基因克隆（基因克隆（gene cloning) 基因操作（基因操作（Gene manipulation ）Short Summar

46、y of gene cloning：LOGOShort Summary of gene cloning： 是指进行制备是指进行制备DNA片段，并通过载体将其片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以细胞中复制、扩增，以获得获得DNA分子分子拷贝的过程。拷贝的过程。What？How？MLOGOWhy？ “”The way to get a DNA clone Gene TherapyGene analysisGene modificationMedicineVaccineTransgenegene knockoutExpressionShort Summar

47、y of gene cloning：LOGO 1973年，年，Cohen和和Boyer第一次完整地第一次完整地建立起了基因克隆体系建立起了基因克隆体系Stanley Cohen (Stanford)Herbert Boyer (UCSF)DNA重组技术创立近重组技术创立近40年来年来所获得的丰硕成果已经把人所获得的丰硕成果已经把人们带进了一个不可思议的科们带进了一个不可思议的科学世界学世界Transformation E.coliPlasmid 1Plasmid 2REREligaseRecombinant plasmidLOGO基因克隆技术基因克隆技术重组蛋白重组蛋白人源抗体人源抗体重组多肽

48、药物重组多肽药物重组疫苗重组疫苗基因克隆基因克隆DNA序列测定序列测定重组载体重组载体基因治疗载体基因治疗载体RNA转录载体转录载体打靶载体打靶载体转基因载体转基因载体基因敲除动物模型基因敲除动物模型转基因动物模型转基因动物模型发夹发夹RNARNAi核酸探针标记核酸探针标记分子杂交分子杂交Southern blotNorthern blot构建文库构建文库基因组文库基因组文库cDNA文库文库基因合成基因合成PCR-克隆克隆-亚克隆亚克隆基因突变基因突变基因克隆技术是分子生物学的核心技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术 LOGO 克克 隆隆 基基 因因 的的 表表 达达 获取重组蛋白获取重组蛋

49、白LOGO亚克隆（亚克隆（Sub cloning）克隆载体克隆载体表达载体表达载体LOGO原核表达系统原核表达系统Prokaryotic expression systemEukaryotic expression system真核表达系统真核表达系统大肠杆菌大肠杆菌酵母酵母昆虫昆虫细胞细胞哺乳动物哺乳动物细胞细胞转化宿主细胞转化宿主细胞Recombinant vectorpromoterTarget geneProteins Transformation/ Transfection LOGO原核表达系统：原核表达系统： 外源基因引入外源基因引入原核原核细胞，使其快细胞，使其快 速高效表达基因

50、产物。速高效表达基因产物。真核表达系统：真核表达系统： 外源基因引入外源基因引入真核真核细胞，细胞，使外源使外源 基因在真核细胞中表达。基因在真核细胞中表达。表达体系表达体系 LOGO第一部分第一部分. .外源基因在外源基因在原核原核细胞中的表达细胞中的表达原核细胞表达原核细胞表达系统组成系统组成二、原核表达载体二、原核表达载体一、原核宿主细胞一、原核宿主细胞Recombinant ProteinLOGO 大肠杆菌大肠杆菌（E.coli)优点：优点：简便简便, , 快速、成本低快速、成本低 可高密度发酵培养可高密度发酵培养20-30min12 hours6-8 Billion bacteria

51、Once the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.insulinRecombinant一、原核宿主细胞一、原核宿主细胞注意：注意：用来用来基因和基因和基因的菌株基因的菌株不一样不一样，表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。LOGO生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。达产物。 基因组结构简单，便于基因操作和分析。基因组结构简单，便于基因操作和分析。 多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的多

52、数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。间构象。 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。定性。 原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点： LOGO 二、原核表达载体二、原核表达载体在在原核原核细胞中细胞中表达表达外源基因的外源基因的载体载体。质粒：质粒

53、：噬菌体：噬菌体：最方便，最方便，最常用。最常用。长片段长片段原核表达质粒原核表达质粒LOGO 强启动子强启动子终止子终止子SDSD序列序列1、原核表达质粒的元件：、原核表达质粒的元件：oriPT7SDMCSTerminatorProkaryotic Expression Plasmid Prokaryotic promoterLac Istart piontAmpicillin resistance克隆元件：克隆元件：表达元件：表达元件：复制原点复制原点插入位点插入位点筛选标记筛选标记LOGO转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此，选择强的、可调

54、控启动子是组建一个高效因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。表达载体首先要考虑的问题。 LOGO最理想的最理想的启动子应该是：启动子应该是：早期阶段早期阶段：启动子被阻遏：启动子被阻遏当细胞数目达到一定密度时当细胞数目达到一定密度时：通过诱导使阻遏：通过诱导使阻遏物失活，物失活，RNA聚合酶快速起始转录。聚合酶快速起始转录。 LOGOPlac： 受受Lac阻遏蛋白负调节，阻遏蛋白负调节， 受受IPTG的诱导。的诱导。PL启动子：噬菌体早期启动子：噬菌体早期 左向启动子。左向启动子。 PR启动子：噬菌体早期启动子：噬菌体早期 右向启动子。右向启动子。受受噬菌体噬菌体

55、CI基基因调控因调控 LOGO RNA Pol.阻遏蛋白以恒定的速度表达，特异性地结合到操作子上，阻遏蛋白以恒定的速度表达，特异性地结合到操作子上，对对的调控：的调控：乳糖或类似物是阻遏蛋白的诱导物。乳糖或类似物是阻遏蛋白的诱导物。LOGOOHOHHHHOHHOHCH2OHOHOHHHHHOHCH2OHOOHIPTG is an analog of lactose but can not be hydrolyzed by galactosidase. Lactose Why IPTG?(Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside, 异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳

56、糖苷) LOGO 乳糖操纵子的应用：乳糖操纵子的应用：利用乳糖操纵子的基本原理构建原核细胞表达载体。利用乳糖操纵子的基本原理构建原核细胞表达载体。IPTG: :类乳糖诱导剂类乳糖诱导剂“O”持续开放持续开放培养基培养基葡萄糖耗尽葡萄糖耗尽“P”开放开放pET vectors and BL(DE3) inducible system (Novagen)LOGO LOGONNNAAGGAGG NNNNNAUG CAA AUUSD SD 与与16S rRNA 316S rRNA 3富含嘧啶的碱基互富含嘧啶的碱基互补配对补配对, ,对蛋白质翻对蛋白质翻译的起始非常重要译的起始非常重要! !39 nt

57、3-11 nt 原核原核mRNA具有独特的具有独特的SD序列序列, 是核糖体结合位点是核糖体结合位点.(ribosome binding site, RBS) LOGO LOGO成熟型成熟型融合型融合型分泌型分泌型减少原核细胞对外减少原核细胞对外源蛋白的降解源蛋白的降解-天然完整蛋白天然完整蛋白-融合蛋白融合蛋白-分泌性蛋白分泌性蛋白2、原核表达质粒的类型：、原核表达质粒的类型：LOGO 1 1）成熟型表达载体）成熟型表达载体oripromoterSDMCSExpression vectorl 外源基因需携带外源基因需携带ATGATG和和TAATAAl 只表达目的基因编码的只表达目的基因编码的

58、氨基酸氨基酸l 产生天然蛋白，容易被产生天然蛋白，容易被降解，因此降解，因此产量小产量小，也，也可能不稳定。可能不稳定。PForeign DNA LOGO2) 2) 融合型表达载体融合型表达载体载体载体1 1：.ATG .ATG ACGACG TCATCA GATGAT. 载体载体2 2：.ATG .ATG N NACAC GTCGTC AGAAGA T.T. 载体载体3 3：ATG ATG NNNNA A CGTCGT CAGCAG AT.AT.ATGATGNATGNATGNATGNNInsert siteInsert siteInsert site LOGO2) 2) 融合型表达载体融合型

59、表达载体LOGOMost popular prokaryotic expression plasmid with his-tag. 融合型表达载体融合型表达载体举例举例LOGO融合蛋白融合蛋白Ni-affinity chromatography6-hisNiNiHis-his-his-his-his-hisIonic bond His-tag Protein可以加入蛋可以加入蛋白酶切位点白酶切位点His taqHis taqTAANcoI (ATG)EcoRIHindIII离子键离子键亲和层析亲和层析LOGO 外源蛋白以融合蛋白的形式表外源蛋白以融合蛋白的形式表达达, 读码框架固定或可选择读码

60、框架固定或可选择 小结小结: 融合型表达载体融合型表达载体表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性 Fusion protein can be purified easily Can be made in large amounts.非天然蛋白，需要表达后切除融合蛋白非天然蛋白，需要表达后切除融合蛋白LOGOSecretion expression vectorsSecreted into medium?(!)E.Coli can not do thatLOGOCell wallCytoplasmic membraneGenome 分泌