5-无菌及微生物检查方法验证

1、1无菌检查及微生物检查方法无菌检查及微生物检查方法2 介绍内容介绍内容一、微生物的基础知识一、微生物的基础知识二、无菌检查方法二、无菌检查方法3 微生物基础知识微生物基础知识 微生物（微生物（microorganism, microbe）是一些）是一些 肉眼看不见的微小生物的总称。肉眼看不见的微小生物的总称。 微生物（微生物（microorganism）包括细菌、支原）包括细菌、支原 体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放线菌）等。（霉菌、酵母菌和放线菌）等。4 细菌（细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其）属于原核细胞

2、型微生物，其特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。繁殖。5 细菌的形态细菌的形态细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百 倍至上千倍才能观察。倍至上千倍才能观察。一般以微米（一般以微米（m）作为测量单位。）作为测量单位。在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌 和螺杆菌。和螺杆菌。经革兰染色法（经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大）可将细菌分成两大类：

3、即革兰阳性菌（类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（）和革兰阴性菌（G-）。）。6 真菌（真菌（fungus；eumycetes） 是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。基质上生长的形态称为菌落。7 真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至可以看到，小的用普通光学显微镜放大

4、数倍乃至千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。 8 药品污染常见的真菌药品污染常见的真菌 毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 一、毛霉属（一、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。起水分高的粮食及食品的霉烂变质。 9根霉属（根

5、霉属（RhizopusEhrenberg） 根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。10 曲霉属（曲霉属（Aspergillus） 曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。本属的有色物质，为有隔的多细胞。本属的常见产毒霉菌有常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的个种，具有强烈的致癌性。致癌性。 11 青霉属青霉属菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生

6、出，无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属的常见产毒霉菌有的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；12 霉菌菌落形态13 霉菌在孟加拉红培养基上的形态霉菌在孟加拉红培养基上的形态14 酵母菌显微镜下形态酵母菌显微镜下形态15 无菌检查法无菌检查法 无菌检查法系用于检

7、查药典要求无菌的药品、医无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 16 无菌保障无菌保障 试验环境试验环境 检验依据检验依据 17 隔离系统的应用隔离系统的应用 应用隔离系统重要的目的应用隔离系统重要的目的是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的作环境及外包装

8、等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检出的要求。可靠性，实现一次检出的要求。是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。的污染。 隔离系统隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。的洁净度须符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。日常检验还需对试验环境进行监控。18 培养基培养基 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基改良马丁培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基葡萄糖肉汤培养基 19 制备培养基的要求制备培养基的要求 培养基的装量与容器高度的比例应

9、符合培养结培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结 束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。 培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否则，须经否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超水浴加热至粉红色消失（不超过过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。分钟），迅速冷却，只限加热一次。 配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。20 培养基的贮存培养基的贮存 制备好的培养基应在制备好的培养基应在2-25、避光保存；、避光保存； 保存在非密容器中，应在保存在非密

10、容器中，应在3周内使用；保周内使用；保存在密闭容器中，可在存在密闭容器中，可在1年内使用。年内使用。21 培养基的适用性检查培养基的适用性检查 无菌性检查无菌性检查 每批培养基随机取不少于每批培养基随机取不少于5支，培养支，培养14天应无菌天应无菌生长。试验可与无菌试验同时进行。生长。试验可与无菌试验同时进行。灵敏度检查灵敏度检查22 菌菌 种种 菌液制备菌液制备黑曲霉菌液的制备黑曲霉菌液的制备培培 养养 基基 接接 种种参照中国药典2010版23 结果判断结果判断 空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。良好，

11、判该培养基的灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照试验同时应做空白对照24 稀释液、冲洗液稀释液、冲洗液 0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠氯化钠-蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。的溶液作为稀释液、冲洗液。 如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。菌后加入表面活性剂或中和剂等。25 阳性对照阳性对照 根据供试品特性选择阳性对照菌：根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌无抑菌作用及抗

12、革兰阳性菌 抗革兰阴性菌抗革兰阴性菌 抗厌氧菌抗厌氧菌 抗真菌抗真菌 加菌量加菌量 结果判断结果判断26 阴性对照阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。性对照不得有菌生长。27 无菌检查法无菌检查法 包括薄膜过滤法和直接接种法。包括薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。28 薄膜过滤法薄膜过滤法 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般薄膜过滤器。薄膜过

13、滤器。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。29可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品。供试品。水溶性供试品直接过滤。供试品直接过滤。可溶性固体制剂供试品。可溶性固体制剂供试品。装有药物的注射器装有药物的注射器供试品和具有导管的医供试品和具有导管的医疗器具的供试品。疗器具的供试品。30 直接接种法直接接种法 供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养基量应符合接种的供试品体积不得大于

14、培养基体基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的积的10%。同时硫乙。同时硫乙 醇酸盐培养基不得少于醇酸盐培养基不得少于15ml、改良马丁培养基不得少于、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基，培养基用量和高度应经方法验证。用量和高度应经方法验证。31 培养及观察培养及观察 培养培养14天，如果培养基浑浊或培养天，如果培养基浑浊或培养14天后从外天后从外观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至同种培养基或斜面上，培养细菌同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌天、真菌3天，天，观察有无菌生长或镜检进行判断。观察有无菌生长或镜检进行判断。 阴性对照

15、不得有菌生长。阴性对照不得有菌生长。32 结果判断结果判断 若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判供试品符合规定。供试品符合规定。 若供试品中任何若供试品中任何1管显混浊并确证有生长供试品管显混浊并确证有生长供试品不符合规定。不符合规定。 除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。 当符合下列至少一个条件时，方可判复试。当符合下列至少一个条件时，方可判复试。 33 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。结果不符合无菌检查法的要求。 回顾无

16、菌实验过程，发现有可能引起微生物污染回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；的因素； 阴性对照管有菌生长。阴性对照管有菌生长。 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。34 方法

17、验证的必要性方法验证的必要性为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方法是至关重要的。因此试验前必须对的检验方法是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验证。选择的方法进行验证。 证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方法适宜于被检供试品的微生物污染的检验。法适宜于被检供试品的微生物污染的检验。 药品无菌检查和微生物检查方法验证药品无菌检查和微生物检查方法验证35 检验结果的影响因素检验结果的影响因素供试品的组分供试品的组分 环境影响环境影响 检验方法检验方法检验条件检验条件36我国无菌和微生物检验方法验

18、证的概况我国无菌和微生物检验方法验证的概况国外无菌和微生物检验方法验证的概况国外无菌和微生物检验方法验证的概况国外无菌和微生物检验方法验证的概况国外无菌和微生物检验方法验证的概况 37 药品微生物检验方法验证的基本要求药品微生物检验方法验证的基本要求 验证试验的设计需综合全面考虑，主要有验证试验的设计需综合全面考虑，主要有以下几方面；以下几方面；供试品特性供试品特性检验目的检验目的 试验全方面验证试验全方面验证 38 当验证试验符合要求时，就可认为在该试验当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试品对微生物无抑菌作用或抑菌条件下该供试品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检验结果可真实的作用可忽略不计，供试品检验结果可真实的体现。体现。39 重新验证重新验证 药品的生产工艺、制剂组分、检验方法或检验药品的生产工艺、制剂组分、检验方法或检验条件发生改变时，应重新进行验证，以确认所条件发生改变时，应重新进行验证，以确认所发生的变化不影响该药品中的微生物检查。发生的变化不影响该药品中的微生物检查。40 验证试验用菌株的要求验证试验用菌株的要求 验证试验用菌株应有代表性。验证试验用菌株应有代表性。 试验菌株应选择非致病性菌株。试验菌株应选择非致病性菌株。试验菌宜选择比较稳定、重现性强的菌株。试验菌宜选择比较稳定、重现性强的菌株。 菌株传代次数不得超