植物组培污染菌种类初探

1、江苏农林职业技术学院 毕 业 设 计论 文SNL/QR7.5.4-3 植物组培中污染菌初探专 业 生物技术及应用 学生姓名 沈 永 恒 班 级 14生物技术及应用1班 学 号 202111130119 指导教师 宋 刚 完成日期 2021年6月 成绩评议学号202111130119姓名 沈永恒 题目 植物组培中污染菌初探 指导教师建议成绩： 评阅教师建议成绩： 辩论小组建议成绩： 院辩论委员会评阅意见及评定成绩：辩论委员会主任签字盖章： 年 月 日毕业设计论文任务书姓名沈永恒学号202111130119班级14生物技术及应用1班题目植物组培中污染菌种类初探 设计(论文)主要内容本文主要研究在植

2、物组培中污染菌的种类、引起污染的原因以及防治的方法。重点研究问题污染菌种类以及防治污染的方法主要技术指标死对头其它要说明的问题指导老师意见 指导教师签字： 年 月 日指导教师意见 对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩 优 良 中 及格 不及格 指导教师签字 年 月 日评阅教师意见 对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩 优 良 中 及格 不及格 评阅教师签字 年 月 日辩论小组评议意见学号202111130119姓名 沈永恒 题目 植物组培中污染菌初探 辩论小组意见： 1、对论文的评价2.建议成绩等级 优 良 中

3、 及格 不及格3.需要说明的问题 辩论小组长签字 年 月 日植物组培中污染菌初探江苏农林职业技术学院 句容 212400摘要：本文主要归纳了在植物组织培养中的污染菌类型、特征以及引起污染的原因和防治污染的方法。文章中主要是细菌类污染、真菌类污染以及病毒类污染，其中以真菌类污染比较常见。本文还给出了防止污染的方法，仅供参考。关键词：植物组培；污染；污染防治A preliminary study on the species of contaminated bacteria in plant tissue culture (Jiangsu Polytechnic College of Agricu

4、lture and Forestry, Jurong, Jiangsu 212400)Abstract: This paper mainly summarizes the types of bacteria contamination in plant tissue culture method, causes and prevention and control of pollution caused by pollution characteristics as well. The article is mainly bacteria pollution, fungi pollution

5、and viral contamination, the fungi pollution is relatively common. This paper gives a method to prevent pollution, for reference.Key words: plant tissue culture; pollution; pollution control目 录1.引言12. 植物组培污染原因12.1离体植物自身的污染12.2外在环境的污染13. 植物组培污染微生物种类13.1真菌23.2病毒23.3细菌34.植物组培污染防治方法3 4.1对接种人员的要求4 4.2对接种

6、环境的要求44.3对器具的要求44.4对培养基的要求54.5对培养瓶的要求54.6对接种材料和接种环境的要求54.6.1对外植体的消毒54.6.2参加抗生素64.6.3操作间的消毒65.结束语6参考文献7致谢81引言随着科技的开展，植物组培技术越来越受到人们的重视，也发挥着越来越大的作用。植物工厂化的育苗、挽救濒临灭绝的珍贵植物、减少病虫害、完善基因库等等都离不开植物组培这一重要技术。虽然植物组织培养操作是在无菌环境中完成的，但是也因为外植体带菌、灭菌不彻底、操作不标准等错误带来一系列的污染。污染带来的危害有很多，比方导致初代培养失败，继代培养增殖系数低，试管苗死亡或者是生长速度慢，玻璃化加剧

7、，移栽困难，成活率低，甚至失败1。对于工厂化生产加大了工厂化生产的本钱、减少了利润、延误了时间、浪费了资源、延缓了工作效率等。 植物组织培养是利用细胞全能性的特点，在无菌条件下，将离体的植物的器官、组织、原生质体培养于人工调配的适合生长的培养基中，在培养基中生根、分化、增殖最后形成完整植株的过程。植物组培的接种、培养苗的转移和继代等都是在无菌的环境下进行。无菌环境的好与坏灭菌时间的长短都是造成污染的主要原因，这也是研究和工厂化生产的关键所在。因此，保证培养材料和培养基的无菌状态及培养室的良好清洁条件，是植物组培成功的最根本的前提2。2植物组培污染原因植物组培污染是指培养物在培养过程中因温度、P

8、H值、湿度、光照、适宜的营养条件等符合其他微生物生长，不利于组培苗生长的，导致在培养过程中产生一系列污染。这些污染一般出现在材料外表、材料附近的培养基以及培养基的其他部位，表现为霉变、混浊或云雾状、粘液状、发酵泡沫状等不同形状、颜色和大小的污染痕迹 3。2.1离体植物自身的污染植物组培中的培养材料大局部都是从自然界天然的环境中选取的，有的取自土壤外表，有的那么是取自土壤的外表以下局部，有的取自于树木及花草等。例如：植物的茎叶、马铃薯、植物的果实或种子。在取材料的过程中往往会出现意外损伤培养材料的外表，使空气中的孢子或者是土壤中的微生物菌进入了培养材料的内部而引起的污染。2.2外在环境的污染由于

9、接种室内空气灭菌不彻底使其室内带菌量太大，接种人员的手部清洗不干净、随意大声讲话和培养基灭菌不当导致的不同程度的污染。3植物组培污染微生物种类在植物组培过程中，导致污染的病原菌种类大致分为真菌类、病毒类以及细菌类。在这三类中真菌和细菌类占的比例比较大。详见以下图1图1.植物组培污染比例图引自百度图片3.1真菌图2.真菌污染图真菌是没有叶绿素的真核微生物，除少数种类是单细胞外,绝大多数是由多细胞组成的。真菌在地球上广泛存在于空气、水、土壤以及各类生物的体表或体内。在室内常附着在物体外表，能自动或随人的活动而扩散于四周。真菌种类丰富，分布广泛，繁殖快速，无处不在。真菌污染在培养基中是呈绒毛状、絮状

10、，界限不太明显，有许多不同颜色的孢子，在接种后的4-8天内开始从外植体处长白毛。真菌污染在培养过程中是最多的。真菌喜欢温暖潮湿的环境，而培养基恰恰给它提供了这样的环境，真菌所产生的孢子随空气飘荡，假设不慎落入培养基中，一粒孢子足以污染整个培养基。酵母菌属外界污染，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色主要来源于工作人员。假设在培养基中出现了真菌，可以利用显微镜进行检测，观察孢子的形态，有无细胞壁的形成。一些情况下，真菌污染也可以用DNA探针做鉴定。详见图23.2病毒病毒是一种只含有DNA或RNA的遗传印子，有很强的寄生能力，病毒颗粒特别微小以纳米为测量单位所以病毒污染的概率比较小。病毒污染难于

11、发现，要用电子显微镜才可以观察到，所以在工厂化生产挑污染的时候，不仅投入了大量的精力、物力、财力，而且还过于麻烦。由于病毒一般潜伏在细胞体内，不会导致整个细胞培养死亡。一般用茎尖分生组织培养来进行脱毒，当然我们在实验室也可用根尖分生组织的。病毒类污染的鉴定是利用DNA有同源性而做探针侦测4。3.3细菌图3.细菌污染图引自百度图片在我们生存环境的四周，细菌是所有生物中数量最多的一类，包括我们人类自身。它无孔不入，泥土里、水里、空气里都有散布，或者和其他生物共生，形状不同，大小不一。细菌污染的特点为在培养基外表或材料外表出现黏液状、菌落或者是浑浊的水迹状并伴有刺鼻气味，有时甚至出现泡沫发酵状，一般

12、在接种1-4天内即能发现。它主要来源于接种工具镊子、剪刀灭菌不彻底或是呼吸排出的细菌，有时由于接种人员的粗心大意，手接触到了接种瓶的瓶口，致使微生物落入，也有时剪到了带菌的植株又未发现，直接剪下一瓶植株而导致的。另外，培养室空间比较大、温度又高、空气湿度也比较高也会增加污染的概率。在接种过程中，可以利用生化反响鉴定细菌类污染。详见图34 植物组培污染防治方法植物组培污染原因是多种多样的，没有固定的方法去整治植物组培污染菌。因此，防治组培苗污染也应多方面考虑，只有确保每个环节的正确进行，才能使工业化生产或者研究产生最小的本钱5。4.1对接种人员的要求图4. 某组培企业接种人员管理制度 操作方面的

13、污染首先要从工作人员的卫生入手，操作人员应及时剪除指甲、勤洗澡的良好卫生习惯，进入无菌区时不能佩戴戒指，不要吃东西，不能喝水以及禁止吸烟。工作服里外要分开，里面的只能在实验室穿，严禁外穿。在进入无菌区前应换好拖鞋，每天用消毒水拖地，工作服在休息的时候要清洗消毒，口罩、帽子要戴好，一次性用品及时更换，进入无菌室前要用肥皂洗手，进入培养室用75%的酒精对双手进行消毒。工作时禁止大声讲话，大幅度走动，以免带动空气中的孢子。详见图44.2对接种环境的要求接种室要保持干净卫生，应每天清扫一遍。每天接种完毕后要用甲酚皂对工作台及接种室消毒。定期检查超净工作台污染情况，紫外灯损坏时要及时更换，每次使用工作台

14、前，应先用巴氏消毒水擦拭工作台内壁，然后用75%的酒精喷洒培养基和接种苗。翻开工作台的紫外灯照射20分钟左右。接种室内的空调应定期清理，由于长时间使用空调而不经常通风，也可以会导致室内真菌污染。有实验说明不定期清理接种室内的空调比经常清理空调会加重污染6 。4.3对器具的要求接种人员使用的镊子、剪刀要严格按照灭菌标准进行灭菌。每天应将使用过的器具放入灭菌器内灭菌，灭菌后浸泡于95%的酒精中，使用时应在酒精灯火焰上灼烧三遍，灼烧一次应沾一些酒精再次灼烧，直至灼烧三遍。每剪完一瓶或两瓶母苗时要进行灼烧。这样就大大减少了器具带菌的导致污染的概率。4.4对培养基的要求培养基是植物组织培养的根底。根据不

15、同的培养物应该配制不同的培养基，培养基在配制时要配置准确无误，没有灭菌的培养基里面有含有许多杂菌，假设不慎接种后会很容易污染，从而加大了工厂化生产的本钱，故培养基应尽快在121、1.41Pa的高压蒸汽灭菌锅里面灭菌20-25分钟，不可超过规定的压力范围,否那么培养基中的蔗糖、有机物质、维生素、激素等物质就会分解,导致培养基变质、变色,降低培养基的pH值,使培养基难以凝固 7 。降温过程不要太过于急躁，切勿翻开排气阀直接进行放气处理，有研究通过比照一次和二次排空气法对培养基的灭菌效果发现，经过两次排气灭菌，没有发生培养基灭菌不彻底现象，而使用一次排气法进行灭菌时，有时会发生因无法排净灭菌锅内空气

16、而使培养基灭菌不彻底8。4.5对培养瓶的要求培养瓶应尽量选择为广口玻璃瓶，有利于在灭菌器具内灭菌，灭菌后应冷却至室温方可取出，以防炸裂伤害到工作人员。如果选择的是专用的塑料瓶，应仔细观察该瓶可以接受的最高温度及压强，该培养瓶符合灭菌条件的可以直接灭菌，如假设不符合，那么用化学杀菌的方法来灭菌，这样就弥补不能高压灭菌的缺陷。4.6 对接种材料要求外植体的选择是组培中的关键因素之一，因此取材应以春夏生长旺季，最好是当年生的嫩梢为佳，应尽量选择晴天，防止阴雨天气，因中午有强烈的太阳光，阳光中的紫外线有利于杀菌，或者取离体枝梢在洁净空气条件下抽芽，然后从新生组织中取材接种。在选取时要注意选择再生能力比

17、较强、遗传稳定、灭菌容易的外植体。另外，胚也是一个很好的外植体材料，在接种材料不太好找的冬天，可以利用植物果实或种子中的胚获得接种材料。4.6.1对外植体的消毒外植体大局部取自大自然，外表附着大量的微生物，在接种前必须将外植体所带的菌杀灭，为了不影响其生长，又不能损伤外植体，所以外植体的消毒是植物组培工作中重要的环节。为到达最正确消毒效果,对于材料内部带菌的组织,有时还需在培养基中参加适量抗生素8 。 外植体消毒时切不可生搬硬套，要根据材料的大小、幼嫩程度、质地等，选择适宜的消毒剂种类、使用浓度和消毒时间，消毒的最正确效果以杀死材料上的所有微生物，而又对材料的损伤最小为好9。消毒果实、种子之前

18、应先检查一下外表有无破损处或者是为了保鲜而涂抹的蜡质。如果无蜡质直接可以用无菌水冲洗，假设有蜡质，那么先用70%酒精浸泡2分钟，然后放进2%的次氯酸钠溶液中浸泡。最后去除果皮，用内生组织或种子接种即可。根和块茎这两种材料一般都常年生长在有大量微生物的土壤环境中，带菌量比较多，故消毒应谨慎彻底。先用小细毛软毛刷子清洗外表，切不可用力和使用硬毛刷子，以防损伤外表。洗刷完毕后，用酒精溶液浸泡30秒，取出，再次浸泡于二氯化汞溶液中5分钟，使用时用无菌水冲洗，然后用无菌纱布或者无菌纸吸干即可。叶片从树枝上摘取后，先用水冲洗掉叶上面的灰尘或者是动物的粪便，然后用酒精浸泡约30s，在用二氯化汞浸泡5分钟然后

19、用无菌水冲洗3次，消毒后的叶片在无菌的条件下既可以接种。4.6.2参加抗生素培养基中参加抗生素是为了防止内生菌造成的污染，提高培养成功的概率。在组培中，常常因为污染而丢弃成百上千的污染物，采用适当的抗生素可以节省大量的的财力、物力、人力以及时间。常用的抗生素有链霉素、青霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等，用量一般为5-20mg/L9。在使用抗生素时要明确抑制病菌的种类，使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响以及抗生素的使用浓度和处理时间。高浓度的抗菌素会伤害植物材料，引起对生长的抑制或畸变。而且抗生素通常只能抑制细菌生长而不能完全杀灭细菌。需要引起重视的是，抗生素有可能会引起微生物

20、产生抗性突变体，使潜伏的污染对植物以后的生长造成影响10。要值得提醒的是，不要以为有了抗生素这一试剂，而放松或放弃灭菌的想法，此外，抗生素要有选择的使用，不可盲目使用，否那么容易导致植物不太适应而停止生长。4.6.3操作间的消毒长期未使用的操作间，使用前应先清扫干净，然后关闭室内窗户，按其甲醛和高锰酸钾的比例配制消毒水，然后使用电炉慢慢加热，不可直接升至高温。消毒后，紧闭室内门窗1周即可使用。或者利用甲酚皂溶液和高锰酸钾进行室内彻底消毒，及时清理污染材料，污染过的培养瓶应在高压灭菌器里面灭菌前方可使用。5结束语植物组织培养目前所面临的问题是组培苗的污染，也是当今组培行业的一大难题，而污染又是多种多样的，研究者们一直在努力解决污染的课题。不同植物污染不同，只有在组织培养过程中高度重视，严格管理控制好每个环节的污染问题，才能降低污染率。随着科学技术不断开展和进步，将会出现更高效、节能的新设备、新技术、新方法应用于组织培养技术，从而有效的控制污染的发生，研究生产出更多更好的植物。参考文献1 巩振辉，申书.植物组织培养第二版M.北京：化学工业出版社，2021.2 谢凤琦，张金莲，董新玉.植物组织培养中常见病原菌种类及污染控制措施J.现代农业科技,2021(2):182-183. 3 屈云慧,杨春梅,蒋亚莲.花卉组织培养中污染的发生与防治J.北方园艺，2007(8): 188