碱性磷酸酶的分离提取

1、碱性磷酸酶的提取鉴定朱* 金* 王* 何*碱性磷酸酶碱性磷酸酶 广泛存在于微生物界和动物界。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。 2如何获取碱性磷酸酶如何获取碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKPAKP）溶于）溶于30%30%乙醇或乙醇或33%33%丙酮丙酮。但在但在60%60%的乙醇或的乙醇或50%50%丙酮丙酮中则形成沉淀。中则形成沉淀。通过通过离心离心可以使可以使AKPAKP和其他蛋白分离，从而和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得到纯化。反复进

2、行纯化的操作，可以获得较高纯度的得较高纯度的AKPAKP。3 1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及鉴定的方法实验目的4 实验原理v碱性磷酸酶在碱性碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性碱性溶 液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。5碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取称取兔肝称取兔肝2g2g, ,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 mol/L0.01 mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液的醋酸镁及醋酸钠混合液4

3、ml4ml, , 进行进行匀浆。将其转入离心管，并加匀浆。将其转入离心管，并加2ml2ml 0.01 mol/L 0.01 mol/L的的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积体积a a，取，取0.1ml0.1ml作为作为A A液液于于EPEP管，待测比活性用。管，待测比活性用。6碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取在离心管中剩余的液体加入在离心管中剩余的液体加入2ml2ml正丁醇，玻璃棒搅正丁醇，玻璃棒搅拌拌 2min2min，室温放置，室温放置30min30min，纱布过滤，置

4、于离心，纱布过滤，置于离心管。管。7碱性磷酸酶的纯化碱性磷酸酶的纯化 滤液加入滤液加入等体积的冷丙酮等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后，边倒边摇，混匀后3000r/min 5min3000r/min 5min。弃上清弃上清，沉淀用，沉淀用4ml 0.5mol/L 4ml 0.5mol/L Mg(AC)Mg(AC)2 2溶解。记录溶解。记录体积体积b b。取。取0.1ml0.1ml作为作为B B液液于于EPEP管，待测比活性用。管，待测比活性用。 在悬液中在悬液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为30%30%（0.460.46体积体积），混匀后），混匀后2000r/m

5、in 5min2000r/min 5min，转移，转移上清液于另一离心管。上清液于另一离心管。 上清液中上清液中缓慢缓慢加入冷加入冷95%95%乙醇使其终体积为乙醇使其终体积为60%60%（0.850.85体积体积），混匀后），混匀后3000r/min 5min3000r/min 5min，沉淀用，沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)4ml 0.01M Mg(AC)2 2、NaACNaAC混合液搅拌混悬。混合液搅拌混悬。8碱性磷酸酶的纯化碱性磷酸酶的纯化 其余悬液中其余悬液中缓慢缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到达到33%（0.5体积），混匀后体积），混匀后

6、2000r/min 离心离心5min，取上清液丢弃沉淀。取上清液丢弃沉淀。上清液中上清液中缓慢缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后体积），混匀后3000r/min离心离心15min。沉淀中加入沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。，即为纯化酶液。作为作为D液液用于比活性测定。用于比活性测定。910碱性磷酸酶活性的鉴定碱性磷酸酶活性的鉴定磷酸苯二钠磷酸苯二钠 磷酸盐磷酸盐 + 酚酚 酚酚 + 4-氨基安替比林氨基安替比林 红色醌类衍生物红色醌类衍生物 AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解是一种底物

7、特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适磷酸基团。最适pH范围为范围为8.810, 需要镁离子作为需要镁离子作为激活剂。激活剂。AKP 铁氰化钾铁氰化钾1112 管号管号 空白空白 标准标准 A B C D酶液体酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.013 加入底物后加入底物后, 立即混匀立即混匀, 37 准确准确15 min后加入后加入0.5%铁氰化钾铁氰化钾2.0 ml终止反终止反应应, 混匀混匀, 静置静置15 min , 510 nm比色比色14 酶活性单位（U/ml)=A样A标*0.1*稀释倍数15 蛋白质含量测定基本原理 BCA法16 17 1819人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋